苦參素對肝臟纖維化的抑制作用

張建榮 劉志剛 李玉芳 李麗華

苦參素(Oxymatrine)是從中藥廣豆根中分離所得的生物堿類，具有抗炎，抗菌，抗病毒，抑制免疫，抗腫瘤等生物學作用［1］。臨床實踐證實，苦參素可以阻止甚至逆轉肝臟纖維化，但其作用機制及調節途徑尚不明確。肝纖維化(hepatic fibrosis)是機體對慢性肝損傷的一種修復反應，是一種漸進的病理過程，是慢性肝病的共有病理變化，是多種類型細胞、氧化應激、細胞因子和生長因子等一系列復雜作用的結果。肝纖維化的特征改變是肝臟內細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)的過度增生和異常沉積，嚴重者的肝纖維化可導致肝硬化，甚至引起肝功能衰竭［2］。肝纖維化已成為一個危害人類生命健康的世界性問題。目前從肝纖維化發生發展的不同環節入手研制了許多抗纖維化藥物，但仍未有十分確定、特效的藥物，因此，尋找理想的抗肝纖維化藥物及有關肝纖維化發病機制的闡明，具有重要的理論和臨床意義。本研究利用四氯化碳(CCl4)制作大鼠肝纖維化和肝硬化動物模型，通過苦參素干預來探討苦參素抗肝纖維化作用的作用機制，為苦參素的臨床防治肝纖維化提供了新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠40只購自河北醫科大學實驗動物中心，體重200 g，隨機分成4組，即正常對照組(Con組)和5%乙醇自來水溶液飲用組(Veh組)，60% 的CCl4處理組(CCl4組)和苦參素干預組(Oxy組)，每組10只。

1.2 模型制作 CCl4組給予60%CCl4溶液皮下注射結合5%乙醇自來水溶液飲用，每只0.3 m l/100 g，1次/d，共14周，制作大鼠肝纖維化和肝硬化動物模型;Oxy組在給予CCl4的同時肌肉注射60 mg/kg苦參素;Veh組飲用5%乙醇自來水溶液;Con組和Veh組每周背部皮下注射0.9%氯化鈉溶液。

1.3 HE染色觀察肝組織變化 每組取5只大鼠，用10%的水合氯醛按300 mg/kg腹腔麻醉動物，4%多聚甲醛經心-升主動脈灌注固定，然后30%蔗糖液中至組織塊沉底，石蠟包埋，切片，常規HE染色。

1.4 Western blot法測I、Ⅲ型膠原和MMP-13蛋白的表達 每組取5只大鼠，取部分肝組織入4℃裂解液勻漿5 min，4℃離心，取上清，Bradford法測定樣本蛋白濃度。樣本蛋白經12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，1∶300稀釋的collagenⅠ，Ⅲ抗體和MMP13抗體4℃過夜，二抗(1∶3 000稀釋)與硝酸纖維素膜雜交。將膜置于ECL中1 min，曝光，顯影，定影。采用美國Kodak公司ID數碼成像分析系統軟件對Western blot結果進行定量分析，結果以目的蛋白與β-actin的積分光密度值的比值表示。

1.5 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用組間SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 Con組和Veh組大鼠肝組織肝小葉結構完整，肝板條索狀以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞無變性、壞死;CCl4組大鼠肝細胞溶解，彌漫性大片壞死，殘留肝細胞成片氣球樣變;肝細胞呈小灶狀壞死明顯多于Con組和Veh組，苦參素干預組大鼠的肝細胞結構形態明顯好于CCl4組大鼠。

2.2 Western blot法測 I、Ⅲ型膠原和 MMP-13蛋白的表達Con組與Veh組三種蛋白的表達無明顯變化。與Con組相比，CCl4組大鼠的CollagenⅠ，Ⅲ的表達顯著增加，MMP-13的表達顯著降低，差別有統計學意義，表現為CCl4組大鼠的CollagenⅠ，Ⅲ的累積光密度與β-actin的比值比Con組分別提高了53.51%(P ＜0.01)和59.57%(P ＜0.01)，MMP-13 的累積光密度與β-actin比值降低了33.53%(P ＜0.01)。苦參素處理后CollagenⅠ，Ⅲ的表達顯著降低，MMP-13的表達顯著則增加，表現為Oxy組大鼠的CollagenⅠ，Ⅲ的累積光密度與β-actin的比值比 CCl4組大鼠分別降低了26.66%(P ＜0.01)和30.75%(P＜0.01)，MMP-13的累積光密度與 β-actin比值增加了38.43%(P ＜0.01)。苦參素處理后CollagenⅠ，Ⅲ的表達沒有降低到Con組水平，而MMP-13增加到了Con組水平。見表1。

表1 4組大鼠CollagenⅠ，Ⅲ及MMP-13，TIMP-13與β-actin比值比較n=5，±s

表1 4組大鼠CollagenⅠ，Ⅲ及MMP-13，TIMP-13與β-actin比值比較n=5，±s

注:與 Con 組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與 CCI4組比較，△P ＜0.01

MMP-13 Con組組別 CollagenⅠ CollagenⅢ1.2532 ±0.1181 1.5089 ±0.0788 1.8083 ±0.0891 Veh 組 1.2839 ±0.0936 1.5036 ±0.0846 1.7800 ±0.1532 CCl4組 1.9238 ±0.0581# 2.4078 ±0.0822# 1.2020 ±0.1313#Oxy組 1.4109 ±0.0848＊△ 1.6674 ±0.0515#△ 1.6639 ±0.0437△

3 討論

本研究通過HE染色和Western blot法顯示，CCl4處理組大鼠能夠引起大鼠肝纖維化和肝硬化，肝細胞溶解，彌漫性大片壞死，CollagenⅠ，Ⅲ的表達增加，MMP-13的表達降低。苦參素處理后大鼠的肝細胞結構形態明顯好轉，CollagenⅠ，Ⅲ的表達顯著降低，MMP-13的表達顯著增加，提示苦參素對肝纖維化具有抑制作用。

肝纖維化是一種可以逆轉的疾病，然而在臨床實踐中還沒有一種滿意的方法來逆轉肝纖維化的病理過程。近年來一些藥物，如antisense TGFβreceptor，細胞活素類，抗氧化劑，soluble typeⅡreceptor of TGFβ1，antibody of TGFβ1等用于肝纖維化的實驗研究，但均未達到理想的效果。研究顯示，肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活認為是肝纖維化過程中最重要的一步［3］。肝纖維化發生的主要機制是肝細胞外基質(ECM)的過度增多和異常沉積。細胞外基質包括膠原，糖蛋白及蛋白多糖等，其中膠原是最主要的成分。在肝臟中有Ⅰ型，Ⅲ～Ⅵ型共5型，而以Ⅰ型和Ⅲ型為主。肝纖維化早期膠原沉積以Ⅲ型為主，后期以Ⅰ型為主。調控膠原代謝的關鍵酶是基質金屬蛋白酶(MMPs)，其中MMP13是基質金屬蛋白酶家族中對肝臟膠原降解作用較強的酶［4］。

因此，本研究推測，苦參素作為一種中藥提取劑能夠增加MMP13的表達，抑制HSC的激活，減少CollagenⅠ，Ⅲ的合成，緩解肝纖維化過程。此外，苦參素能保持肝星狀細胞的增殖/凋亡的平衡，可以減少細胞外基質的產生，起到抗肝纖維化作用，這為苦參素的臨床防治肝纖維化提供了新的理論依據。

1 李丹，王平金，張楠森.苦參堿類生物堿的研究進展及臨床應用.中草藥，1996，27:308-311.

2 Fallowfield J，Hayes P.Pathogenesis and treatment of hepatic fibrosis:is cirrhosis reversible.Clin Med，2011，11:179-183.

3 Reeves HL，Friedman SL.Activation of hepatic stellate cells--a key issue in liver fibrosis.Front Biosci，2002，7:808-826.

4 孫嫵弋，桂雙英，吳麗，等.芍芪多苷對肝纖維化大鼠肝臟星狀細胞基質金屬蛋白酶13及組織金屬蛋白酶抑制因子1表達的影響.中國中藥雜志，2010，35:1447-1451.