不同牛奶消費量對雄性ICR小鼠生殖系統的影響

高強 劉建 石劍 賈中驕 馬玉霞

動物性食品中含有相當數量雌性激素，如雌激素和黃體酮［1］等，隨著人們生活質量的提高，動物性食品的消費量也在逐漸增加，導致雌激素攝入量的增加，從而使和雌激素相關的疾病發病率增加，如男性前列腺癌和睪丸癌等;同時男性的生殖質量在全世界范圍下降［2］，包括精子數量下降、隱睪和睪丸不降的上升等，也均與環境激素有關。研究表明，人類食物中雌激素的70% ～80%來自牛奶［3］，本研究以小鼠為研究對象，以了解牛奶是否對實驗動物的生殖系統產生影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組 22 d齡ICR小鼠(購于北京維通利華實驗動物技術有限公司)96只，雌雄各半，稱重編號，隨機將實驗動物分為4組:5 ml牛奶組，10 ml牛奶組，15 ml牛奶組，對照組。置于(24±2)℃的恒溫動物房內。

1.2 給飼方法 雌雄分籠飼養，6只一籠。4組實驗動物給與基礎飼料(購于河北醫科大學實驗動物中心)，自由攝食。同時給予清潔衛生的城市自來水，自由飲用。除基礎飼料外，5 ml牛奶組，10 m l牛奶組，15 ml牛奶組分別按照 5 ml/只、10 ml/只、15 ml/只的劑量給予牛奶(市售某品牌)，給飼方式為自由飲用。

1.3 一般觀察 除每天觀察小鼠行為、外觀變化外，每周進行一次體重稱量，經過牛奶飼喂12周后，同組別小鼠以雌雄1∶1的比例同籠，同籠時間為6 d。每天觀察并記錄雌鼠陰栓情況，沒有觀察到陰栓的雌鼠如懷孕也被記作交配成功，計算交配率。在雌雄小鼠同籠6 d后，無論是否發現陰栓，均將雄鼠和雌鼠分開，雌鼠繼續喂養，觀察懷孕率。交配率(%)=發現陰栓或懷孕的雌鼠數量/和雄鼠同籠的雌鼠數量×100%懷孕率(%)=懷孕的雌鼠數量/發現陰栓的雌鼠數量×100%。

1.4 小鼠血清中激素檢測 同籠結束后，雄鼠采用乙醚麻醉，股動脈取血，采用放射免疫分析法檢測實驗動物血清中雌二醇、雌三醇、睪酮含量。

1.5 生殖器官觀察 分離精囊腺、附睪、睪丸，采用1/10 000電子分析天平稱量濕重并錄入計算機分析。

1.6 精子計數 稱重后，將左側附睪置于已加入5m l0.9%氯化鈉溶液的4 cm平皿中，用眼科剪將附睪均勻剪為6段，置于37℃溫箱中溫育5 min。溫育過程完畢后在平皿中取50μl懸浮液滴入血細胞計數板，置于顯微鏡下記錄鏡下4個大方格內精子數。精子計數計算公式為N=M×4×L/0.0001×W。N:每克附睪組織中的精子數;M:平均每個大方格中的精子數。L:液體體積;0.0001:計數池總體積(ml);W:附睪重量(g)

1.7 組織學觀察 生殖器官稱重后，用10%甲醛固定標本24 h后，序列酒精脫水，石蠟包埋切片，HE染色，制成光鏡病理片。

1.8 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，對生殖系統器官重量進行多個均數比較的方差分析，方差不齊時采用多個獨立樣本非參數檢驗。食物消費量與體重變化采用重復測量設計資料的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物的一般情況及體重 實驗過程中ICR小鼠生長狀況良好，活動正常，在整個實驗過程中未見死亡。雄鼠5 m l牛奶組、10 ml牛奶組的體重增長較快，與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.05);15 ml牛奶組、對照組之間及5 m l牛奶組、10 m l牛奶組、15 ml牛奶組之間的體重增長差異無統計學意義(P ＞0.05)。見圖1。

圖1 體重變化

2.2 雄性ICR小鼠生殖器官濕重與相對重量 牛奶3組的雄性ICR小鼠附睪和精囊腺濕重均低于對照組，但幾組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。牛奶3組睪丸、附睪、精囊腺的相對重量均低于對照組，但差異差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 4組生殖器官重量比較n=12，±s

表1 4組生殖器官重量比較n=12，±s

相對重量(g/kg)組別 附睪 睪丸 精囊腺5 m l牛奶組 91.35 ±14.58 0.25 ± 0.05 0.19 ± 0.06 2.27 ±0.37 6絕對重量附睪(mg) 睪丸(g) 精囊腺(g).53 ±1.17 5.96 ±2.22.13 ±1.25 4.66 ±1.42 10 ml牛奶組 84.72 ±16.45 0.25 ± 0.05 0.21 ± 0.06 2.13 ±0.39 6.23 ±1.34 5.29 ±1.43 15 ml牛奶組 88.67 ± 15.34 0.26 ± 0.06 0.23 ± 0.05 2.18 ±0.32 6.38 ±1.34 5.67 ±1.54對照組 95.89 ± 32.32 0.26 ± 0.05 0.24 ± 0.09 2.38 ±0.61 6

2.3 精子計數 雄性ICR小鼠精子計數結果，牛奶3組和對照組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 4組精子計數比較n=12，±s

表2 4組精子計數比較n=12，±s

精子計數組別5 m l牛奶組20±11 10 ml牛奶組 16±10 15 ml牛奶組 19±10對照組15±8

2.4 血清中激素水平檢測 5 m l牛奶組、10 m l牛奶組、15 ml牛奶組雄性ICR小鼠血清中雌二醇含量均高于對照組，且有劑量反應關系，牛奶量攝入量越高，雌二醇含量越高;而血清中雌三醇的含量均低于對照組，睪酮含量均高于對照組，差異均無統計學意義(P ＞0.05)。見表3。

表3 4組激素水平比較n=6，±s

表3 4組激素水平比較n=6，±s

組別 雌二醇(pg/m l) 雌三醇(ng/m l) 睪酮(ng/dl)5 m l牛奶組2.2 ±1.6 20 ±5 1 436 ±1 765 2.9 ±1.0 16 ±5 1 542 ±717 10ml牛奶組 3.0±1.9 16±6 1 555±1 324 15 ml牛奶組 3.8±0.8 18±3 1 746±1 496對照組

2.5 交配率與懷孕率 5 ml牛奶組、10 ml牛奶組、15 ml牛奶組和對照組之間的交配率與懷孕率差異無統計學意義(P＞0.05)。見表 4。

2.6 組織學觀察 光鏡下未發現睪丸精管內生精細胞有脫落、壞死、變質等明顯的病理改變，睪丸間質內未見有出血、水腫、增生、炎癥細胞浸潤等。高倍鏡下精原細胞、精母細胞、精細胞界線清楚、細胞形態完整，間質細胞形態正常。附睪輸出小管和附睪管上皮細胞形態完整，基膜明顯。

表4 4組交配率與懷孕率比較 n=12，例(%)

3 討論

近年來，世界范圍內出現了男性生育質量下降和生殖系統疾病發病率上升的現象，這些問題被認為與“環境雌激素”有關。環境雌激素主要通過水、空氣、食物作用于人體，其中食物是一個將環境雌激素暴露于人體的重要途徑。在東西方膳食結構與生殖系統健康的相關研究中，相當多的流行病學結果提示生殖系統發病率與動物性食品中牛奶有關。西方國家過去50年睪丸癌發病率的增加，被認為可能與牛奶及乳制品的消費量有關。在英國進行的一項病例對照調查發現，患有睪丸癌患者少年期牛奶的消費量明顯高于對照人群［4］。Qin等［5］分析了大量的文獻后提出牛奶及乳制品中的雌激素可能為前列腺癌發生的誘因之一。還有相應的研究顯示，現在商業化牛奶與之前的牛奶相比，其中的雌激素的含量有上升的趨勢［6，7］。為此，我們進行了一項牛奶對ICR雄性小鼠生殖系統影響的研究。

實驗中發現，在實驗動物在總熱能攝入無明顯差異的情況下，5 ml、10 ml牛奶組的雄鼠體重增長較快，自第7周開始持續到最終，與對照組相比差異有統計學意義。15 m l組每周體重增長均數高于對照組，但無明顯差異。這與本課題組在日本進行一項關于牛奶對ICR小鼠生殖能力影響的一代交叉繁殖實驗結果相符［8］。在生殖器官的濕中與相對重量的比較中可以觀察到，經牛奶干預的雄性ICR小鼠生殖器官重量普遍偏輕，但無統計學差異。能夠反映生殖能力的精子計數、交配率、生育率也未見異常。但本課題組在另一項實驗中曾發現在親代小鼠均為牛奶飼喂的情況下，有2只雌鼠僅產仔6只［8］。推測其原因有可能是牛奶種類不同導致的，已有報導證實，不同品種奶牛或者不同喂養方式所生產的牛奶［7，9，10］，在雌激素含量水平上存在一定的差異。

血清激素水平檢測未見陽性結果，但就檢測數據來看，不同劑量牛奶干預后的雄性ICR小鼠血清中雌二醇水平均高于對照組，且存在劑量反應關系。有研究報導，牛奶中的雌激素水平可以影響到人體雌激素的代謝［11，12］。雌二醇主要作用于下丘腦，如果人體獲得的雌激素過多將會打破下丘腦—垂體—睪丸軸，從而對成年后睪丸的大小和精子數量產生影響，并有可能影響精子的質量［13］，并可干擾睪丸的下降［14］。

本次實驗沒有發現不同量牛奶的消費對ICR小鼠的生殖系統和生育能力有明顯的影響，但就目前的研究資料，還不能夠排除牛奶具有降低生育能力作用，尚需進一步研究。

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3 Hartmann S，Lacorn M，Steinhart H.Natural occurrence of steroid hormones in food.Food Chemistry，1998，62:7-20.

4 Bergstrom R，Adami HO，Mohner M，et al.Increase in testicular cancer incidence in six European countries:a birth cohort phenomenon.NatiCaneer Inst，1996，88:727-733.

5 Qin LQ，Wang PY，Kaneko T，et al.Estrogen:one of the risk factors in milk for prostate cancer.Med Hypotheses，2004，62:133-142.

6 Wolford ST，Argoudelis CJ.Measurement of estrogens in cow’smilk，human milk，and dairy products.Dairy Sci，1979，62:1458-1463.

7 袁麗君，徐莊劍，胡瑜，等.部分牛奶中雌二醇和孕酮的含量分析.中國食品衛生雜志，，2007，19:139-141.

8 Yu －Xia MA，Naoyuki EBINE，Kazuo AKOI.Effectsof Cow’sMilk on reproduction in ICR Male Mice.Biomedical And Environmental Sciences，2002，22:161-163.

9 李湘鳴，劉秀梵.牛奶中雌性激素樣物質對雄性大鼠生殖腺的影響.衛生毒理學雜志，2003，17:97-100.

10 周虹，王燕，王培玉.市場牛奶和傳統牛奶對乳腺癌發生影響的研究.中華腫瘤防治雜志，2008，15:1536-1539.

11 Hill P，Wynder EL，Garbaczewski L，et al.Diet and urinary steroids in black and whit North American men and black South Africanmen Cancr Res，1979，39:5101-5105.

12 Bernstin L，Ross RK.Endogenous horm ones and breast cancer risk.Ep idem iol Rev，1993，15:48-65.

13 杜傳策，宋樂明，胡敏，等.前列腺體積與血清雌二醇覃酮濃度及其比例關系的研究.中國全科醫學，2011，14:159-160.

14 Charles G，Crispens JR.Handbook on The Laboratory Mouse.Charles C Thomas Publisher，Springfield Illinois，USA，1975，116:296-299.