13號染色體缺失與多發性骨髓瘤預后相關性的研究

徐洪偉，賀 飛

（哈爾濱醫科大學附屬第二醫院 檢驗科，黑龍江 哈爾濱150086）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以漿細胞異常增生為特征的一種惡性腫瘤疾病，占血液系統腫瘤的10%、全身惡性腫瘤的1%［1］。好發于中老年人，近年來由于我國人口老齡化及人們對該病的認識水平提高，該病發病率有逐漸增加趨勢。染色體異常是MM預后的重要指標，而常規染色體G顯帶技術操作繁瑣，周期長，干擾因素多，準確性和特異性欠佳，只有約3%的患者檢測結果為陽性，對治療反應的判斷及微小殘留病灶的檢測較為困難。隨著熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）、比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）、光譜核型分析（spectral karyotyping，SKY）等細胞遺傳學和分子生物學技術的發展，MM細胞遺傳學研究領域有較大進展。本研究采用I－FISH 技術，應用D13S319特異性探針，探討 MM患者的細胞遺傳學異常與臨床特征的關系。

1 材料和方法

1．1 標本收集 2005－2009年我院確MM診病例64例，男44例，女20例，年齡34－85歲，中位年齡62歲；符合國內MM的診斷標準［2］，確診前均未接受過化療和其他特殊治療。I－FISH對照組選用同期10例非血液系統惡性疾病核型正常患者。

1．2 實驗方法

1．2．1 免疫固定電泳采用美國Helena公司全自動快速電泳分析系統（Rapid Eleetrophoresis，REP），重鏈IgG、IgA、IgM和輕鏈κ、λ進行免疫電泳后，與相應抗體形成復合物被固定，然后進行染色、洗脫、掃描等。

1．2．2 免疫球蛋白定量采用美國 Beckman－Cou1ter IMMAGE免疫化學分析儀，以速率散射比濁法定量測定。

1．2．3 試劑 免疫固定電泳均用Helena公司生產的試劑盒。免疫球蛋白定量使用美國Beckman－Coulter公司生產的試劑盒。

1．2．4 常規核型分析 取肝素抗凝骨髓，先行有核細胞計數，以1×106－2×106／ml的密度注入10ml培養液，加有絲分裂原刺激劑PHA72小時，于終止培養前2－4小時加入秋水仙素終止中期分裂相后常規染色體標本制備。制備的染色體標本保存于－20℃，采用氣干法滴片，Giemsa液染色，在顯微鏡下觀察50個中期分裂相，核型描述依據《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN1995）》。

1．2．5 間期熒光原位雜交（interphase fluorescence in situ hybridization，I－FISH）探針 檢測探針為針對13q14缺失的探針（D13S319），購自基因有限公司。（1）玻片制備：骨髓細胞懸液氣干法滴片，在室溫下過夜老化；將玻片在37℃新鮮配制的RNase A溶液中孵育30min，室溫放置30min；室溫下于2×SSC（pH7．0）溶液中漂洗玻片2次，依次置于室溫的70%、85%和100%乙醇中梯度脫水，自然干燥玻片。（2）變性雜交：玻片在74℃ 變性液（70%甲酰胺／2×SSC）中變性5min后在乙醇中梯度脫水，自然干燥；置于46℃烤片機上等待雜交；將10μl探針混合物（按照探針∶去離子水∶雜交緩沖液為2∶1∶7的比例混合）于74℃水浴中變性5min，46℃水浴10－15min后滴于玻片雜交區域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊；將玻片置于預熱的濕盒中，42℃溫箱中過夜雜交。（3）玻片洗滌：移去蓋玻片，置于65℃0．4×SSC／0．3%NP－40 洗滌液中洗滌 2 min，在室溫0．1%NP－40／2×SSC洗液洗滌1min，取出后暗處自然干燥，（4）熒光顯微鏡觀察：每份標本加10μl DAPI復染，用蓋玻片封好后置于暗盒中10－20min后，用熒光顯微鏡觀察間期細胞熒光雜交信號數目。每個探針計數200個細胞，用Isis－FISH圖像軟件采集圖像。

1．2．6 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測 采空腹靜脈血，分離取血清，應用BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動生物化學分析系統，速率法340nm測定LDH活性，＞250U為異常。

1．2．7 β2微球蛋白（β2－microglobulin，β2－MG）檢測應用Hitarchi全自動免疫分析系統，免疫比濁法測定β2－MG含量。

1．2．8 白蛋白檢測（albumin，ALB）采靜脈血，分離心血清，應用BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動生物化學分析系統，溴甲酚綠法測定。

1．2．9 血肌酐（Creatinine，CRE）檢測 采靜脈血，分離血清，應用 BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動生物化學分析系統，苦味酸法測定。

1．3 統計學方法

數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，應用SPSS17．0統計軟件采用χ2、Fisher’s確切概率法檢驗分析MM患者中13號染色體缺失與13號染色體正常組之間 LDH、Creatinine、β2－MG、ALB的差異。應用Kaplan－Meier方法繪制生存曲線。用Cox回歸模型進行單因素及多因素分析，找出影響總體生存的預后因素。P＜0．05視為有統計學意義

2 結果

2．1 64例MM患者一般資料 見表1。

表1 例64MM患者臨床特征

2．2 常規染色體核型分析及I－FISH檢測結果64例MM患者進行常規染色體核型8例（13%）未收獲淋巴細胞，56例獲得中期分裂相，其中13號染色體缺失28例（44%）（見表1）。傳統核型分析中8例異常，其中13q－2例（與I－FISH結果一致），亞二倍體2例，t（11；14）（q13；q32）1例，7q－2例，超二倍體1例。

2．3 13號染色體缺失與13號染色體正常組生存差異與相關因素分析 將13號染色體缺失與13號染色體正常兩組患者采用 Kaplan－Meier法評估生存曲線，13號染色體正常組患者生存時間長 （P＝0．036）。將可能影響生存的因素如性別、年齡、白蛋白等進行Cox逐步回歸分析，結果顯示在排除β2－MG、Creatinine、白蛋白、血紅蛋白的影響條件下，13號染色體完整性是影響生存時間的獨立因素，13號染色體正常組患者生存時間長（見圖1）。在排除13號染色體的影響后，β2－MG對生存時間有影響，β2－MG值越高，生存時間越短，低β2－MG患者的死亡風險降低了59．82% （95%C I：0．14～0．59，P＝0．041）。13號染色體缺失與13號染色體正常兩組患者在疾病進展方面存在顯著差異（P＝0．042）。

圖1 13號染色體缺失與正常組患者生存曲線

3 討論

多發性骨髓瘤是惡性漿細胞病中最常見的一種類型，又稱骨髓瘤、漿細胞骨髓瘤，其病理機制尚未闡明，預后與 MM患者的血紅蛋白、肌酐、Ca2＋和M蛋白、免疫分型及骨髓漿細胞數密切相關。

常規染色體G顯帶技術由于骨髓漿細胞在體外的有絲分裂指數低下而受到限制，即使獲得足夠的中期分裂相，有些染色體異常仍然檢測不到，通常只有1／6左右的患者核型分析結果陽性。常規染色體G顯帶技術可以檢測到的染色體異常通常為10－12Mb大小。I－FISH 技術通過檢測DNA探針與MM患者染色體異常所在靶區域的特異性結合（通常20－50Kb），對于染色體數目異常檢測的敏感性明顯優于常規染色體G顯帶技術［3］，且同時適用于分裂期和間期細胞，可以鑒別出很小的突變區域［4］。幾乎所有的 MM患者均存在染色體異常，且多為復雜核型異常，其中以涉及1、14號染色體結構異常和13號染色體的全部或部分缺失最為常見［5，6］。13號染色體缺失在漿細胞疾病中較為普遍，且存在于 MM 的各個階段，未見于正常人［5］。不同研究結果顯示 MM患者中13號染色體缺失發生率約26%－50%［5，3，7］。13號染色體缺失的最小缺失區仍未精確定位。目前認為，染色體13缺失的致病主要經由以下兩個途徑：（1）特定基因的單倍基因功能不全（例 GTF2F2，TSC－22和 RB1等）；（2）細胞周期基因的擴增表達（例CCNB1，UBE2C等）［8，9］。其他與13號染色體缺失相關的分子水平改變還有：DNA修復缺陷、IGF1－IGF1R自分泌生長信號轉導環路形成等，可能在發病過程中也具有重要作用［8］。對13號染色體缺失分子水平改變進行深入研究，將為MM患者提供新的治療靶點。

本研究顯示，64例初診 MM患者中28例（44%）13號染色體缺失，并且與β2－MG水平升高呈正相關，提示細胞遺傳學異常與MM患者的腎功能衰竭等臨床特征有內在聯系。13號染色體缺失組患者生存時間縮短，提示13號染色體缺失與MM的疾病進展、侵襲性病程、生存期縮短及預后關系密切。13號染色體缺失可以為MM的評估預后提供可靠依據。

綜上所述，13號染色體缺失在 MM的發生、發展中可能起重要的作用，13號染色體缺失檢測可用于MM患者的臨床狀態、療效監測和預后判斷。

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