TIMP3及MMP－9在結腸癌中的表達及臨床意義研究

高東生，曾 飛，熊炳賢，宋偉勇

（1．永康市第一人民醫院，浙江 永康321300；2．南昌大學第二附屬醫院，330006；3．寧波市腫瘤醫院，315000；4．永康市第一人民醫院，321300）

結腸癌是對人類健康危害極大的惡性腫瘤。近年來，隨著國內膳食結構的改變等，結腸癌的發病率和死亡率近年來顯著上升，且具有年輕化的傾向。侵襲及轉移的發生是結腸癌最為常見的死因，結腸癌的侵襲及轉移的發生極大的影響了結腸癌患者的預后，其轉移和浸潤與多種因素密切相關，其中腫瘤分泌的蛋白酶，包括基質金屬蛋白酶家族等均具有重要的作用［1］，本研究探討基質金屬蛋白酶抑制劑－3（TIMP3）及基質金屬蛋白酶－9（MMP－9）在結腸癌中的表達及臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料

收集我院于2006年3月至2009年3月收入的手術切除后結腸癌標本60例，所有患者術后經過病理證實為結腸癌者。其中男27例，女33例。年齡29－81歲，平均年齡53．6歲。所有患者均排除家族性結腸癌病史、術前放療、化療，排除使用非甾體抗炎藥史、排除伴有其他腫瘤病史，所有標本經過10%福爾馬林固定后且4μm厚的連續切片用于免疫組織化學檢測。

1．2 實驗方法

所有標本均經過10%的中性甲醛固定后石蠟包埋，并進行4μm厚的切片，行免疫組化SP染色，試劑包括鼠抗人 MMP－9單克隆抗體，鼠抗人TIMP－3單克隆抗體和SP試劑盒（均購自福建邁新生物技術有限公司），選取PBS代替一抗作為陰性對照，全部實驗嚴格按照SP法操作流程進行染色。

1．3 結果判斷

免疫組化嚴格按說明書進行，其中 MMP－9表達于細胞質當中，呈現棕黃色細顆粒狀。TIMP－3表達于細胞質當中，呈棕黃色顆粒著色。結果判斷采用Formowitz法［2］綜合計分，在400倍鏡裝入100目的測微網格，每點陣計算1000個腫瘤細胞，并計算陽性細胞的百分比。其中0分未見陽性細胞，陽性細胞占1%－25%為1分，陽性細胞占26%－50%為2分，陽性細胞占51%－75%為3分，陽性細胞大于75%為4分。陽性強度方面：黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。兩組積分相乘時陰性（－）為0分、弱陽性（＋）為1－4分，中度陽性（＋＋）為5－8分，強陽性（＋＋＋）為9－12分。

1．4 相關指標評價

將患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、Duke’s分期、分化程度浸潤深度、淋巴結轉移以及CEA水平表達納入結腸癌相關性分析，以探討TIMP3及MMP－9表達在結腸癌中的意義。

1．5 統計學處理

采用SPSS17．0統計學軟件進行統計處理；計量資料采用均數±標準差（ˉx±s）表示，多組比較采用單因素方差分析；陽性率比較采用配對卡方檢驗；指標間相關性分析采用Spearman等級相關性分析。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 MMP－9表達與結腸癌臨床病理特征相關性分析

將患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、Duke’s分期、分化程度以及CEA水平表達納入結腸癌與MMP－9的相關性分析中，結果顯示Duke’s A＋B期的MMP－9陽性表達率顯著低于Duke’s C＋D期的陽性表達率，結果對比有統計學意義，P＜0．05。具體見表1。

2．2 TIMP－3表達與結腸癌臨床病理特征相關性分析

將患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、Duke’s分期、分化程度以及CEA水平表達納入結腸癌與TIMP－3的相關性分析中，結果顯示Duke’s A＋B期的TIMP－3陽性表達率顯著高于Duke’s C＋D期的陽性表達率，結果對比有統計學意義，P＜0．05。具體見表2。

2．3 MMP－9及TIMP－3單獨表達與結腸癌侵襲相關性

表1 MMP－9表達與結腸癌臨床病理特征相關性分析

MMP－9及TIMP－3單獨表達與結腸癌侵襲相關性分析中，MMP－9、TIMP－3的單獨表達與結腸癌的侵襲存在統計學意義（χ2值分別為18．642、11．254，P值分別為0．000、0．001）。具體見表3。

表2 TIMP－3表達與結腸癌臨床病理特征相關性分析

表3 MMP－9及TIMP－3單獨表達與結腸癌侵襲、轉移相關性

2．4 MMP－9及TIMP－3單獨表達與結腸癌轉移相關性

MMP－9及TIMP－3單獨表達與結腸癌轉移相關性分析中，MMP－9、TIMP－3的單獨表達與結腸癌的轉移存在統計學意義（χ2值分別為9．032、8．542，P值分別為0．002、0．003）。具體見表4。

表4 MMP－9及TIMP－3單獨表達與結腸癌轉移相關性

2．5 MMP－9及TIMP－3蛋白在結腸癌中表達相關性研究

MMP－9及TIMP－3蛋白在結腸癌中表達相關性研究中顯示，結腸癌中 MMP－9及TIMP－3表達進行配對卡方檢驗（P＝0．009），說明這兩種蛋白存在相關性，Spearman等級相關性分析顯示兩種蛋白之間存在著顯著負相關，具體見表5。

表5 MMP－9及TIMP－3蛋白在結腸癌中表達相關性研究

3 討論

結腸癌是人類最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率隨著人群生活方式的改變均呈逐年上升的趨勢，在結腸癌的發生、發展過程中，其機制在不斷的變化。結腸癌的轉移和侵襲是指腫瘤細胞的直接擴散及不連續擴散的過程，并在腫瘤以外的部位生長，其基本過程包括脫離、侵入、循環、粘附及生長等［3］。惡性腫瘤的轉移和侵襲是復雜、多變的，轉移和侵襲的過程中受到多個基因的調控，不同腫瘤均具有著獨特的生物學特征，但腫瘤的表面細胞外基質以及基底膜的降解及破壞是腫瘤浸潤、轉移的先決條件［4］。基質金屬蛋白酶家族是具有催化細胞外基質降解作用的主要酶類，MMP－9是基質金屬蛋白酶家族中分子量最大的酶［5］，其主要由中性粒細胞、巨噬細胞、惡性腫瘤細胞以及毛細血管內皮細胞等分泌產生的，其以酶原形式分泌而成，激活后形成的IV型膠原酶通過降解、破壞表面基底膜中的膠原從而促進腫瘤的侵襲及轉移過程，這也是大多數惡性腫瘤侵襲的第一步［6］。雒洪志等［7］認為 MMP－9不但可以通過降解、破壞靠近腫瘤表明的基底膜，從而促進腫瘤細胞沿著被破壞的基底膜周圍組織進行浸潤侵襲，還可以通過新生血管生成來達到促進腫瘤生長、擴散的目的。本組研究中，對MMP－9單獨表達與結腸癌侵襲相關性分析中，MMP－9的單獨表達與結腸癌的侵襲及轉移均存在統計學意義（χ2分別為18．642、9．032，P值分別為0．000、0．002），表明 MMP－9與結腸癌的侵襲、轉移密切相關。TIMP是組織金屬蛋白酶抑制家族成員，可抑制基質金屬蛋白酶的活性［8］，Hoque MO 等人［9］研究發現，大腸癌中TIMP－3表達水平下降與腫瘤侵襲轉移密切相關。Liu MC等人［10］認為 TIMP－3的高表達可誘導腫瘤細胞的凋亡，并抑制原發腫瘤的生長及血管的生成。本組研究表明，TIMP－3表達陽性率降低與結腸癌侵襲及轉移存在統計學差異（χ2分別為11．254、8．542，P值分別為0．001、0．003）。此外，臨床病理分析對比中Duke’s A＋B期的 MMP－9、TIMP－3陽性表達率與Duke’s C＋D期的陽性表達率對比有統計學差異，結果表明 MMP－9、TIMP－3與結腸癌患者預后存在一定的相關性。

MMP－9及TIMP－3蛋白在結腸癌中表達相關性研究中顯示，結腸癌中 MMP－9及TIMP－3表達進行配對卡方檢驗（P＝0．009），說明這兩種蛋白存在相關性，Spearman等級相關性分析顯示兩種蛋白之間存在著顯著負相關，

在MMP－9及TIMP－3蛋白在結腸癌中表達相關性研究中，本組研究表明結腸癌中的MMP－9及TIMP－3表達存在者相關性（P＝0．009），而在Spearman等級相關性分析中表明，MMP－9及TIMP－3表達存在著負相關，我們可以認為MMP－9及TIMP－3可以通過共同作用于結腸癌的侵襲和淋巴結轉移的過程當中，MMP－9及TIMP－3可以作為預測結腸癌侵襲、轉移及預后的分子生物學指標而應用于臨床當中。

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