銅綠假單胞菌醫院感染現狀及分子流行病學研究

潘紅玲，劉鳳芹，馮永欽

（枝江市人民醫院，湖北 枝江443200）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一類氧化酶陽性的非發酵革蘭陰性桿菌，是院內感染的主要病原菌之一，容易在ICU和神經外科、燒傷科、血液科、骨髓移植中心等醫院科室進行播散并引起爆發性感染的條件致病菌。近年來，隨著抗生素的濫用常引起醫院感染的爆發和流行，且近年來發病呈上升趨勢［1－3］。因此，進行銅綠假單胞菌臨床分布分型研究，對指導臨床合理用藥和控制此菌耐藥菌株上升有著十分重要的意義。現將本地區2年來所檢出的240株銅綠假單胞菌的臨床分布及基因分型情況報道如下。

1 材料與方法

1．1 菌株來源

240株銅綠假單胞菌分離于本院2009年1月—2010年12月期間住院患者送檢的標本。標本類型包括痰、尿液、血液、傷口分泌物、膿液、引流液、胸水和腹水等。

1．2 試劑

氨曲南，環丙沙星，頭孢吡肟，亞胺培南，頭孢他啶，哌拉西林，哌拉西林／他唑巴坦，慶大霉素藥敏紙片均購自OXOID公司；隨機引物5，－GTTGGTGGCT－3，委托上海生物工程有限公司合成；細菌基因組DNA提取試劑盒、dNTP、100bp DNA Ladder、Taq DNA Polymerase均購自上海生物工程有限公司。

1．3 細菌鑒定

所有分離菌株的培養鑒定嚴格按照美國國家臨床實驗室標準委員會（CLSI）標準，采用BD全自動微生物鑒定系統對所有收集的菌株進行菌種鑒定。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1．4 RAPD分型

采用隨機擴增多態性DNA（RAPD）基因分型進行細菌同源性鑒定

1．4．1 細菌DNA提取 用接種環挑取純菌落接種于3ml LB肉湯培養液，將裝有LB培養液的試管置于震蕩培養箱中，37℃，140rpm／min，16－24小時培養至細菌生長對數期。然后取培養液，按照上海生物工程有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明進行DNA提取，提取的DNA模板置于－20℃保存備用。

1．4．2 RAPD基因分型 PCR反應體系參照上海生物工程有限公司Taq DNA Polymerase說明。PCR反應循環：94℃5min；94℃35s，42℃30s，72℃40s（30個循環）；72℃ 5min。PCR產物電泳，用凝膠成像系統觀察PCR結果。

2 結果

2．1 送檢標本分布情況

2009年1月至2010年12月住院患者送檢標本6400例，其中銅綠假單胞菌240例。銅綠假單胞菌的分布情況是：痰標本174株（72．5%）、傷口分泌物36株（15．0%）、尿液24株（10．0%）、其他臨床標本6株占2．5%。科室分布主要為ICU 118株（49．2%），呼吸內科24株10．0%）、普外科36株（15%）、神經外科24株（10．%）、神經內科15株（12．5%），其他科室8株（3．3%）。

2．2 240例銅綠假單胞菌的藥敏結果

120株銅綠假單胞菌的多重耐藥情況非常嚴重，對亞胺培南／美羅培南耐藥率分別32．0%和35．0%，對其它大多數抗菌藥物的耐藥率為70%以上；具體見表1。

2．3 RAPD分型

對本次分離的240株銅綠假單胞菌進行隨機擴增多態性DNA（RRAPD）基因分型，共分為7種類型：A－G。其中A型72株，B型54株，C型32株，D型28株，E型22株，F型18株，G型14株。

表1 240株銅綠假單胞菌的藥敏結果（%）

3 討論

銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，主要引起機體免疫力低下患者的機會性感染，可定植人體多個部位如皮膚、呼吸道、消化道和泌尿道，該菌還可引起醫院感染的暴發流行，現已成為醫院感染的常見病原菌［1－3］。本研究結果顯示，銅綠假單胞菌最主要來源于痰標本，其次是傷口分泌物和尿液標本標本。240株標本臨床分布主要來自ICU，呼吸內科，燒傷科，其中主要發現有49．2%的銅綠假單胞菌分布于ICU，表明可能存在本院ICU小范圍的交叉感染。這提醒醫療人員應該加強醫院感染監測，以防在醫院形成爆發流行。

240株銅綠假單胞菌對亞胺培南／美羅培南耐藥率分別32．0%和35．0%，對其它大多數抗菌藥物的耐藥率為70%以上，說明本地區銅綠假單胞菌的多重耐藥情況非常嚴重，應引起重視。

由于細菌的耐藥性受多種遺傳因子的綜合影響，不穩定，耐藥譜分型只能作為流行病學調查的篩選，而不宜作為可靠的調查方法，因此單用耐藥譜分型是不可靠的。RAPD技術是在聚合酶鏈反應基礎上建立的揭示基因組多態性的分型方法，該技術的最大特點是不需要預先知道基因組序列，因而具有巨大的應用前景．現已已廣泛用于細菌等微生物的基因分型，且方法簡單易行、可用于分子流行病學調查，追蹤傳染源；同時由于RAPD分型對種和株的分辨率高，可作為銅綠假單胞菌鑒定和分型的有效手段，可在分子水平上對銅綠假單胞菌感染提供病原學及流行病學的研究，在早期發現和預防其交叉感染有重要意義［4，5］。本研究結果顯示，本地區2011年檢出的240例銅綠假單胞菌分為中7個基因型，其中主要以A、B 2型為主，表明我院醫院感染銅綠假單胞菌可能存在院內的克隆傳播。

總之，細菌耐藥性特別是銅綠假單胞菌耐藥問題是目前臨床抗感染治療的一個難題，為了減少耐藥菌的產生，我們應該要常規監測臨床常見細菌的耐藥性和分子流行病學現狀，預測細菌耐藥性變遷，以及合理使用抗生素。

［1］Cavalcanti FL，Almeida AC，Vilela MA，et al．Changing the epidemiology of carbapenem－resistant Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian teaching hospital：the replacement of S？o Paulo metallo－β－lactamase－producing isolates［J］．Mem Inst Oswaldo Cruz．2012，107（3）：420．

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［3］鄧清軍．重癥監護病房銅綠假單胞菌肺部感染49例臨床分析［J］．臨床肺科雜志，2008，13（4）：463．

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［5］晏 群，陳麗華，劉文恩，等．分子生物學分型技術ERIC－PCR的建立［J］．實用醫學雜志，2003，19（6）：688．