甲狀腺乳頭狀癌患者p16基因表達及意義

尹鳳媛

（青島市市立醫院 輸血科，山東 青島266011）

腫瘤是一類細胞周期疾病，是多基因長期共同作用的結果［1］。抑癌基因是指能夠抑制細胞癌基因活性的一類基因，其功能是抑制細胞周期，阻止細胞數目增多以及促使細胞死亡。p 16基因是新近發現的抑癌基因，它以甲基化、突變或缺失等異常形式廣泛存在于各種腫瘤患者中。p16基因又稱為多腫瘤 抑 制 基 因 （multiple tumor suppressor 1，MTS1），定位于人類染色體9p21，全長8．5kb，由3個外顯子（exon）和2個內含子（intron）組成，3個外顯子分別為126、307和11bp，它們共同編碼分子量為16kDa的核苷酸蛋白（CDK4的抑制蛋白），即p16蛋白。p16含有4個獨特的錨蛋白重復結構，該結構與其抑制活性有關。p16既是細胞周期有效的調控因子，又是抑制腫瘤生長的關鍵成分。p16與cyclinD競爭性結合CDK4或CDK6，特異性地抑制CDK4或CDK6的活性，使Rb蛋白脫磷酸化，進而阻止細胞從G1期進入S期，抑制細胞無限增殖，促進細胞衰老。正常情況下p16與cyclinD處于平衡狀態，當p16基因由于甲基化、基因突變或基因缺失等原因而不能正常表達時，cyclinD便與CDK4／6優勢結合，使細胞生長失去控制，細胞表型產生變化，導致腫瘤的形成。甲狀腺癌是一種常見的、病因未明的內分泌性惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌（PTC）約占60%－80%。我們對PTC患者血液p16基因表達情況進行了檢測，現報告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 我院2009年3月至2010年11月收治的原發性PTC患者121例（原發組），男性31例、女性90例，年齡36．3±14．0歲；伴淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌患者41例（轉移組），男性11例、女性30例，年齡40．1±13．4歲。上述兩組患者均經病理組織學與免疫組化檢查確診，其中原發組臨床分期I～Ⅱ 期82例、Ⅲ～Ⅳ 期39例。對照組為130例健康體檢者，男性43例，女性87例；年齡33．9±20．2歲。三組一般資料具有可比性。

1．2 血液p16基因表達檢測 三組均抽取空腹靜脈血4ml，EDTA－K2抗凝，－20℃保存待檢測。①PCR擴增：PCR反應體系為50μl，p16基因點異常（主要發生在外顯子2、3中）二對引物設計參見國內外文獻［2］。②單鏈構象多態（SSCP）分析：取10μl PCR反應產物，加入等量95%甲酰胺染料（20 mmol／L EDTA，0．1%溴酚蘭），95℃保溫7min后立即置于冰浴中7min；然后用8%聚丙烯酰胺凝膠4℃下電泳3h，至溴酚蘭接近凝膠底部。③用硝酸銀染色后判斷結果：將待分析樣品與對照樣品的條帶進行比較，判斷待分析樣品p16基因表達情況。當p16基因啟動因子甲基化、基因突變或等位基因失活等而不能正常表達時，與對照樣品條帶比較出現不表達。

1．3 統計學處理 采用SPSS 10．0軟件進行統計學處理，所得數據百分率比較采用χ2檢驗。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 根據以上方法得出，121例原發性甲狀腺乳頭狀癌患者和41例淋巴結轉移甲狀腺乳頭狀癌患者的p16基因異常顯著高于對照組，轉移組的p16基因異常顯著高于原發組（P＜0．05）。見表1

臨床分期Ⅲ～Ⅳ 期的原發病例中p16的表達水平與臨床分期I～Ⅱ 期者有明顯差異（P＜0．05）。見表2

表1 原發組、轉移組與對照組p16基因異常頻率例數（%）

表2 原發組臨床不同分期p16基因異常例數（%）

3 討論

遺傳物質突變將導致細胞增殖周期失去控制，或同時引起其他腫瘤抑制因子損失及癌基因激活，從而引發腫瘤，是導致腫瘤發生的主要原因，p16基因編碼的蛋白是細胞周期監控、驅動機制中最主要的調控蛋白，直接參予細胞周期的調控、負調節細胞增殖及分裂，是細胞周期有效調控因子，亦是抑制腫瘤細胞生長的關鍵因素。p16蛋白抑制Cdk4活性，是作用于細胞分裂周期（Cell Division Cycle）關鍵酶之一的CDK4的抑制因子，一旦p16基因因甲基化、缺失、突變等異常導致表達降低、功能缺失，則不能抑制CDK4，可導致細胞無限的增殖、惡變［3］，最終使細胞進入惡性增殖，加速腫瘤發生。p16基因已經在多種腫瘤患者中發現異常表達，因此，檢測p 16基因的異常表達，是判斷腫瘤的性質及預后的一項重要指標。甲狀腺癌患者中p16基因的失活主要表現為啟動子區的高甲基化。p16基因的甲基化可能是一個獨立因素，參與了PTC的浸潤與轉移［4］。p16基因在不同患者、腫瘤發生發展的不同時期，甲基化的位點和頻率均不同，這可能與組織細胞的代謝水平、分裂水平不同相關，是導致細胞周期紊亂的重要原因之一［5］。本研究顯示，PTC組和轉移組血液p16基因異常率均顯著高于對照組，其中轉移組的p16基因異常率顯著高于PTC組，同時，研究發現PTC組Ⅲ～Ⅳ期患者p16基因異常率顯著高于I～Ⅱ期的患者。這表明在甲狀腺乳頭狀癌的發病過程中存在p16蛋白的基因表達異常，同時，研究顯示p16蛋白的表達與甲狀腺乳頭狀癌的分化程度有關，且分化程度越低的甲狀腺乳頭狀癌，p16基因表達異常的頻率越高，缺失率也越高，臨床分期越晚。總之，p16蛋白表達缺失可能是因為腫瘤晚期的分子生物學改變，因此可作為評估腫瘤細胞增殖活性的一種指標。甲狀腺乳頭狀癌發病率近幾年呈上升趨勢，已成為臨床常見腫瘤，觀察甲狀腺乳頭狀癌患者p16的表達變化對判斷患者腫瘤的易感性、預測腫瘤的預后和病理鑒別診斷有一定指導意義。在臨床工作中有助于甲狀腺乳頭狀癌的診斷和預測預后，但其作用機制還有待于進一步研究。

［1］Andratschke N，Grosu AL，Molls M，et al．Perspectives in the treatment of malignant gliomas in adults［J］．AR，2001，21（5）：3541－3591．

［2］Baehmann MA，Shapiro SE，Pettier ND．BET Protoancngene：a review and of genotype－phenotype corralationsin hereditary medullary thyroidⅢcer and associated endocrinetumors［J］．Thyroid，2005，15（6）：531．

［3］周清華，石應康，侯 梅，等．人非小細胞肺癌p16基因突變研究［J］．中國胸心血管外科臨床雜志，1977，（4）：67．

［4］彭正良，曹仁賢，文格波，等．甲狀腺乳頭狀癌組織中p16基因甲基化的研究［J］．現代腫瘤醫學，2006，14（12）：1501．

［5］宋愛林．甲狀腺乳頭狀癌68例臨床分析［J］．河北醫藥，2008，30（10）：1565．