3種流感病毒檢測方法的比較和應用

張巍巍，張麗榮，胡 鈺

（1．密云縣疾病預防控制中心，北京101500；2．吉林大學中日聯誼醫院 病理科，吉林 長春130033）

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，其傳染性強、傳播速度快，主要通過空氣中的飛沫、人與人之間的接觸或與被污染物品的接觸傳播［1］。對流感樣病人進行快速鑒別診斷，不僅能迅速掌握疫情，而且可為臨床治療提供可靠的病原學依據。本文采用逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）法、實時熒光定量RT－PCR法和細胞培養法3種方法檢測流感病毒，比較3種方法的特異性和靈敏度，以確定其適應領域。

1 材料與方法

1．1 標本來源

2010年12月至2011年2月，密云縣醫院采集流感樣病例398件咽拭子。流感樣病例（ILI）指發熱（體溫≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一。樣本采集方法按照《甲型H1N1流感監測方案》（第1版）［2］。咽拭子標本于24h內冷藏送至本實驗室，24h內未能檢測的－80℃保存。

1．2 細胞培養法

吸1ml咽拭子接種到75%－90%生長成片的MDCK細胞，34℃5%CO2吸附2h，37℃5%CO2培養箱中培養，每日觀察細胞病變（CPE）。培養3－4d后，用1%豚鼠血球進行微量血凝試驗 （HA）檢測病毒的存在及滴度。將 HA＜1∶8的培養物繼續細胞傳代培養，HA≥1∶8的培養液用血凝抑制試驗 （HI）進行流感病毒滴度和型別鑒定。

1．3 提取RNA

病毒核酸的提取方法詳見QIAGEN RNeasy Mini Kit試劑盒說明書。

1．4 普通RT－PCR

普通RT－PCR采用QIAGEN公司的One Step RT－PCR Kit。反應體系為25μl：DEPC處理H2O 11．9μl；5×buffer 5μl；引物0．5μl；10mM dNTPs 1μl；酶混合物1μl；酶抑制劑0．1μl；RNA模板5 μl。反應條件：反轉錄42℃10min；50℃30min；預變性95℃15min；變性94℃30sec；退火52℃30 sec；延伸72℃1min；最終延伸72℃10min。共34次循環。電泳30－40分鐘后，于UVP凝膠成像系統下觀察電泳條帶。每次實驗都以RnaseP（人上皮細胞總RNA）基因為對照，以保證標本的合格和實驗的準確性。

1．5 實時熒光定量RT－PCR

熒光定量RT－PCR采用美國ABI公司提供的Taqman One step RT－PCR Kit。反應體系總體積為25μl：引物（40μM）0．5μl；探針（10μM）0．5μl；酶1．0μl；2×Master Mix 12．5μl；Rnase Free H2O 5．375μl；40× MultiScribe and RNAase Inhibitor Mix 0．625μl；RNA 模板5μl。反應條件：50℃反轉錄30min；95℃預熱15min；95℃變性15s；55℃擴增45s；在45℃進行單點熒光檢測，共45個循環。實時熒光檢測有標準的S型擴增曲線，并且Ct值＜30可以判斷樣本為陽性。

1．6 3種檢測方法靈敏度的比較

為了研究3種方法檢測流感病毒的靈敏度，對流感病毒株H3型，采用MDCK細胞進行病毒校價滴定（105TCID50／ml），然后稀釋成100、10、1、0．1、0．01、0．001TCID50，然后提取 H3亞型的 RNA 核酸，分別采用細胞培養、RT－PCR方法與熒光定量RT－PCR方法進行檢測。比較3種檢測方法的靈敏度，并同時做平行試驗。

1．7 統計學處理

數據采用SPSS 13．0進行數據統計處理，比較組間陽性率差異，P＜0．05具有統計學意義。

2 結果

2．1 3種檢測方法的結果比較

普通RT－PCR共檢測出陽性樣本93件，熒光定量RT－PCR方法檢測陽性樣本129件，MDCK細胞培養病毒分離獲得64株流感病毒。3種檢測方法的陽性率分別為23．4%、32．4%和16．1%。經數據統計處理，三者的陽性率有明顯的統計學差別（P＜0．05），熒光定量RT－PCR法的陽性率明顯要高于普通RT－PCR和細胞培養法。

2．2 3種方法檢測流感病毒各型及亞型結果

通過細胞培養法HAI鑒定的64株流感病毒分型及亞型結果與普通RT－PCR和實時熒光定量RT－PCR分型完全符合。從表1中可以看出2011年9月至2012年2月密云縣流感病毒主要以B型和甲3亞型為主，而其中新甲型H1N1和H1亞型沒有檢測到。

對于陽性率較高的B型，普通RT－PCR、實時熒光RT－PCR和細胞培養3種檢測方法檢測的陽性率分別為20．4%、26．4%和14．6%，經計算三者陽性率具有統計學差異（P＜0．05）。同樣，H3亞型的陽性率分別為3．0%、6．0%和1．5%，經計算三者陽性率也具有統計學差異（P＜0．05）。熒光定量RTPCR法檢測H3亞型、B亞型的陽性率明顯高于其他兩種方法。各亞型陽性結果分布詳見表1。

表1 各流感病毒亞型檢測結果

2．3 3種檢測方法的靈敏度

分別采用細胞培養、RT－PCR方法與熒光定量RT－PCR方法對不同稀釋度的H3核酸樣本進行檢測。熒光定量RT－PCR檢測結果為100、10、1、0．1、0．01TCID50的核酸樣本均有標準的S型擴增曲線，并且Ct值＜30，而稀釋度0．001TCID50的樣本S型擴增曲線不明顯，檢測結果為陰性。這與胡曉武等［3］報道一致。普通RT－PCR法檢測結果為0．01、0．001TCID50兩稀釋度在紫外下觀察無條帶，結果為陰性。細胞培養法0．1、0．01、0．001TCID50稀釋度下無細胞CPE現象，并且HA檢測結果為陰性。熒光定量RT－PCR方法隨著病毒稀釋度的增加Ct值增加，其靈敏度明顯要高于另外兩種方法。

表2 3種方法的靈敏度對比

3 討論

RT－PCR技術作為流感病毒的重要檢測方法，以其操作簡單，靈敏度高，耗時短等優點，已經被廣大實驗室所采用［4］。普通RT－PCR鑒定流感病毒的優點是電泳條帶可以凝膠回收，為后續的實驗提供原料。缺點是在檢測過程中容易造成污染，產物需要后期處理。因此，為保證實驗結果準確性，我分子生物學實驗室分4個隔開的獨立工作區（即標本制備區、擴增反應混合物配制區、擴增區、擴增產物分析區），進入各個工作區必須嚴格遵循單一方向的順序進行，不同區的儀器設備、物品如加樣器、試劑等不能發生混淆。在實驗中，以無RNA酶的水作為空白對照，只有空白對照無條帶，檢測樣本有特異性條帶才能說明試劑無污染，RT－PCR結果可信。我分子生物學實驗室嚴格做好質量控制，避免PCR產物對環境的污染，減少假陽性結果的產生。

實時熒光定量RT－PCR是在普通RT－PCR技術的基礎之上發展起來的具有高靈敏性和準確性的一項定量技術，現在已經作為流感病毒感染的主要篩查方法。通過實驗結果表明，實時熒光定量RTPCR應用于甲3型流感病毒檢測，靈敏度達到了0．01TCID50，在縮短檢測時間的同時，大大提高檢測靈敏度和特異性。而且由于整個檢測過程都在封閉管中進行，能有效防止擴增產物的交叉污染，確保實驗的準確。實時熒光RT－PCR檢測結果不需要用紫外燈觀察條帶，直接通過電腦軟件收集熒光信號并在電腦上顯示擴增曲線，具有結果只管、重復性好、特異性和敏感性強、操作簡易等優點。與普通PCR技術相比，實時熒光PCR方法已廣泛應用于病原學檢測的日常工作［5－9］。細胞培養法是流感病毒分離的經典方法，此法技術要求嚴格，操作復雜，實驗周期長，對樣本中病毒的含量要求高。細胞培養法分離流感病毒可以保證病毒抗原性與原始毒株相近，且可以長時間保存，對于核實疫情實驗室診斷和病原學監測具有重大意義。從實驗結果可以看出，細胞培養的檢出率與病毒的濃度有嚴格的要求，當病毒濃度不大時，可能會有假陰性結果。細胞培養是培養活的病毒株，所以流感病毒標本在采集、運輸、保存過程中應注意不要被滅活，因此，在優化分離技術的基礎上，應加強標本質量管理。另外，MDCK細胞的代數和敏感度與流感病毒的分離有很大的關系。總之，MDCK細胞培養法是流感病毒檢測實驗結果準確、最常用的方法之一，是各種快速診斷方法無法替代的。

本文采用細胞培養、普通RT－PCR和實時熒光RT－PCR 3種方法對398件流感樣本同時進行檢測，通過結果比較驗證，表明實時熒光RT－PCR對流感病毒的檢出率最高，這與其他文獻的檢測結果一致［10］。與另外兩種方法相比，無論從敏感性、特異性還是從時間上，熒光RT－PCR對于疫情的爆發更有應用價值。而細胞培養法能夠分離到病毒本身，對于流感病毒監測有重要意義，有助于流感病毒病原性分析。所以在日常流感監測實驗中，主要以細胞培養法為主。

另外，流感病毒的檢測方法還有多重PCR、基因芯片、間接免疫熒光法、依賴核酸序列的擴增技術（NASBA）等［11］，在流感防控工作中，我們要靈活選擇和運用這些檢測技術，發揮每種技術的優點，只有這樣才能提高工作效率的同時保證實驗結果的準確性。

［1］Chidlow G，Harnett G，Williams S，et al．Duplex real－time RTPCR assays for the rapid detection and identification of pandemic（H1N1）2009and seasonal influenza viruses A／H1，A／H3and B．J Clin Microbiol，2010，48：862－9－866．

［2］中華人民共和國衛生部．甲型H1N1流感監測方案（第1版）［S］．http：／／www．moh．gov．cn／publicfiles／business／cmsresources／mohjbyfkzj／cmsrsdocumentMoc4308．doch．

［3］胡曉武等．一步法實時熒光RT－PCR在快速檢測甲型流感病毒中的應用［J］．臨床輸血與檢驗，2010，12（4）：296．

［4］石偉先，劉海林．逆轉錄聚合酶鏈反應法在北京市流感病毒型別鑒定中的應用［J］．中華預防醫學雜志，2002，36（6）：382．

［5］程小雯，周 麗，趙 錦．熒光定量RT－PCR在流感病毒檢測上的應用［J］．中華實驗和臨床病毒學雜志，2004，18；289．

［6］Nalia F Habib－Bein，William H Beckwith Ⅲ，Donald Mayo，etal，Comparison of Smart Cycler Real－Time Reverse Transcription－PCR Assay in a Pulic Health Laboratory with Direct Immunofluerenscence and Cell Culture Assay in a Medical Center for Detection of Influenza A viruses［J］．Journal of clinical M icrobiology，2002，2：750．

［7］史芳芳，李紅葉．不同方法檢測流感病毒的敏感性［J］．國際檢驗醫學雜志，2011，32（18）：2119．

［8］陳雙峰等．實時熒光RT－PCR檢測不同標本中甲型H1N1流感病毒核酸的臨床意義［J］．國際檢驗醫學雜志，2011，32（8）：861．

［9］Bergallo M，Terlizzi ME，Astegiano S，et al．Real time PCR Taq－Man assays for detection of polyomaviruses KIV and WUV in clinical samples［J］．J Virol Methods，2009，162（1－2）：69．

［10］李 嬋，盧亦愚，嚴菊英等．實時熒光定量逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）法與RT－PCR法及細胞培養法檢測甲3型流行性感冒病毒的比較［J］．中國計劃免疫，2005，11：360．

［11］薛文仲等．流感病毒的檢測和分型技術研究進展［J］．生物技術通訊，2011，22（4）：559．