肺結(jié)核病人血清差異蛋白的分離及鑒定

李翠萍，胡天橋，農(nóng)炳金，臧 寧，周 怡，胡水秀，鄭艷燕，周昌明，何 敏

（1．廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 南寧530021；2．廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心，廣西 南寧530021；3．廣西龍?zhí)夺t(yī)院，廣西 柳州545001；4．廣西疾病預(yù)防控制中心，廣西 南寧530021）

痰涂片是作為活動性結(jié)核病簡單又快速的檢測方法，僅適用于細菌量大于104的痰樣本［1］，涂片陰性和潛伏感染的肺結(jié)核病人的檢測成為結(jié)核病預(yù)防、控制和治療的一大難題。因此，通過檢測除了痰液之外的其他臨床樣本比如血液、尿液等來尋找結(jié)核病快速和可靠的診斷方法成為了很多研究的熱點。本研究的前期工作中，利用SELDI技術(shù)篩選出6個肺結(jié)核病人血清差異表達蛋白構(gòu)建診斷模型，明顯提高結(jié)核病診斷的靈敏度與特異度（另文發(fā)表），這6個血清差異表達蛋白分子量分別為M4953．58、M4748．18、M4895．39、M4480．14、M6933．89、M8778．35，其中 M4480．14、M8778．35在肺結(jié)核病人血清中低表達。本研究的目的在于分離、鑒定診斷模型中目標蛋白。

1 材料和方法

1．1 血清標本來源 結(jié)核組：6例肺結(jié)核病人（男3，女3，平均年齡35歲），均為2008年9月在廣西南寧市第四人民醫(yī)院確診的住院病人，經(jīng)痰結(jié)核菌檢查陽性（包括涂片或培養(yǎng)）；胸部X線檢查有典型的活動性結(jié)核病變表現(xiàn)；臨床診斷為結(jié)核病并且排除合并其他疾病的病例。正常對照組：6例正常人（男3，女3，平均年齡38歲），為同時期廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，既往無與肺結(jié)核病類似的呼吸系統(tǒng)疾患，胸部CT檢查未見異常，無消化系統(tǒng)疾患，在全身體檢中未發(fā)現(xiàn)任何疾病。

1．2 實驗方法

1．2．1 樣品的收集 所有血樣均于清晨空腹采集，用無抗凝劑的5ml普通采血試管，冰上分裝血清并－80℃低溫保存。

1．2．2 Tricine－SDS－PAGE 電泳分離差異表達蛋白 分別等體積混合6例正常人血清和6例肺結(jié)核病人血清，將混好的樣品經(jīng)過兩倍的乙腈、離心和凍干處理后，取20μl加尿素的Tricine－SDS－PAGE檢測。切取差異條帶，膠內(nèi)酶解樣品。

1．2．3 LC－MS／MS鑒定差異表達蛋白 消化好的樣品用C18反相柱（美國Agilent公司）分離并進行串聯(lián) LCQ－DECA－XP（Thermo Finnigan公司）plus電噴霧離子阱質(zhì)譜鑒定。多肽離子檢測范圍為400－2000amu，隨后進行二級質(zhì)譜鑒定。二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)用SEQUEST （Bioworks 3．0）軟件進行檢索。搜索使用的蛋白數(shù)據(jù)庫為ipi．HUMAN．v3．36蛋白庫。SEQUEST結(jié)果過濾參數(shù)為：當Charge＋1，Xcorr≥1．9；當Charge＋2，Xcorr≥2．2；當Charge＋3，Xcorr≥3．75；其中DelCN≥0．1。

2 結(jié)果

2．1 Tricine－SDS－PAGE電泳分離 對經(jīng)乙腈沉淀法處理后的肺結(jié)核病人和正常人血清樣本進行3次重復(fù)電泳圖，蛋白質(zhì)條帶的重復(fù)性較好。圖1顯示其中一張血清電泳圖譜，14．4KD以下小分子量蛋白條帶清昕可見，箭頭所指條帶在正常人血清的濃度明顯高于肺結(jié)核患者血清且分子量小于6．5kD，與前期診斷模型中潛在標志蛋白M4480．14分子量分布范圍和表達水平均一致。對這一條帶切膠酶解后質(zhì)譜鑒定。

圖1 Tricine－SDS－PAGE電泳分離圖

2．2 串聯(lián)LCQ－DECA plus電噴霧離子阱質(zhì)譜鑒定

按照方法1．2．4設(shè)置SEQUEST過濾參數(shù)共鑒定出12個蛋白，圖2顯示的是質(zhì)譜鑒定Basepeak圖及其中一個母離子的二級質(zhì)譜圖。在這12個蛋白中apolipoprotein C－I precursor可信度最高，覆蓋率達39．76%，且有5個不重復(fù)的肽段被鑒定（如表1所示）。

圖2 蛋白條帶的質(zhì)譜鑒定圖

2．3 目的蛋白的確定及其生物信息學(xué)分析 在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫里搜索人類apolipoprotein C－I precursor的氨基酸序列為82個氨基酸。本研究所鑒定到的5個不重復(fù)肽段，分布于第36－75位之間的40 個氨基 酸。查 詢 http：／／www．expasy．ch／tools／#proteome網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)這40個氨基酸組成的多肽存在多個酶切位點，其中酶切片段efgntledkarelisrikqselsakmrewfsetfqkv理論分子量為4433．02Da，與本研究SELDI篩選出6個肺結(jié)核病人血清差異表達蛋白構(gòu)建診斷模型中潛在標志蛋白4480．14Da分子量非常接近，因而判斷SELDI檢測到4480．14Da潛在標志蛋白可能為apo C－I的酶解片段。

表1 Apo C－I肽段匹配情況

3 討論

質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白的發(fā)展激起人們發(fā)現(xiàn)和鑒定結(jié)核病新的標志物的興趣。蛋白鑒定的重要意義性在于每一個蛋白都具有可以改變的細胞功能，與結(jié)核有密切聯(lián)系的蛋白，在疾病狀態(tài)時發(fā)生改變并可能釋放進入血液中，鑒定血清中的這些蛋白有助于闡明結(jié)核病發(fā)病機理，使尋找結(jié)核病標志物成為可能。

利用蛋白質(zhì)組技術(shù)研究血清標志物受到血清中高豐度蛋白蛋白的影響，正常人血清中的20余種高豐度蛋白占血清總蛋白的99%以上，其余的上千種可能與疾病診斷密切相關(guān)的小分子蛋白含量甚微［2－4］，同時，血清中蛋白質(zhì)濃度的動態(tài)范圍變化很大，至少達到109數(shù)量級，因而很難在最大辨別幅度僅為104聚丙烯酰胺凝膠上得以顯示，眾多高中豐度蛋白的存在必然嚴重干擾小分子蛋白質(zhì)的分離［5］。因此高豐度蛋白的去除和低豐度蛋白的富集己成為血清樣品處理中的首要步驟，通過這個步驟可明顯提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量、色譜分離的峰容量和質(zhì)譜檢測的動態(tài)范圍等［6－9］。有研究表明與其他有機溶劑相比，乙腈沉淀法是一種去除高豐度蛋白重復(fù)性和效果最好的方法，在血清中加入兩倍的乙腈，能夠有效的破壞小分子蛋白與白蛋白的結(jié)合，降低生物標志物丟失的可能［10］。CHERTOV［10］等亦用高效液相串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜的方法發(fā)現(xiàn)血清用乙腈沉淀后能發(fā)現(xiàn)更多小分子量蛋白和肽峰，得出此方法能使結(jié)合在白蛋白等載體蛋白的小分子蛋白和肽分開的結(jié)論。同樣地，Richard［11］也指出乙腈沉淀法能夠簡便、快速地、重復(fù)性好地去除血清中高豐度蛋白，已經(jīng)成為一種普遍應(yīng)用的質(zhì)譜鑒定的前期處理方法。本研究通過乙腈沉淀法處理血清樣品，電泳結(jié)果清晰地呈現(xiàn)了10KD以下小分子蛋白條帶。

在結(jié)核病血清標志物的鑒定方面已有一些報道，比如，Agranoff等［12］鑒定出2個最有鑒別力的標志物，一個是血清淀粉A，另一個是轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白。吳雪瓊等［13］采用SELDI技術(shù)篩選肺結(jié)核差異蛋白并采用 C18－HPLC 分離和 MALDI－TOF－MS跟蹤方法，成功地對質(zhì)荷比峰為5643m／z的蛋白進行了分離、純化，并應(yīng)用LC－MS／MS鑒定為粘蛋白。本研究經(jīng)過3次的SDS－PAGE分離肺結(jié)核患者和健康人血清蛋白質(zhì)，均發(fā)現(xiàn)一條分子量小于6．5KD的差異蛋白質(zhì)條帶，LC－MS／MS鑒定為apo C－I蛋白的酶解片段。Apo C－I是載脂蛋白A家族中組分之一，在血清中含量較低，關(guān)于其在體內(nèi)確切的生物學(xué)功能尚不清楚。近年來，有人曾報道apo C－I是結(jié)腸直腸癌、前列腺癌和肝纖維化的潛在血清標志物［14－16］，但其與肺結(jié)核的關(guān)系尚未得知。近期不少研究者研究結(jié)果證實肺結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展與載脂蛋白有著相 當 密 切 的 關(guān) 系［11，17，18］，說 明 載 脂 蛋 白 類代謝途徑與結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。大多數(shù)的肺結(jié)核病人都會出現(xiàn)消瘦，乏力等癥狀，這些癥狀或許跟脂類代謝失調(diào)有關(guān)，Perez［19］等已證實肺結(jié)核病人血清的總膽固醇水平低于正常人。Deniz［20］等發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病人組的血清膽固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白復(fù)合物，低密度脂蛋白復(fù)合物的濃度顯著低于正常人，其中上述指標涂陽病人又低于非涂陽的，開放性肺結(jié)核又低于涂陽的。同時有研究表明［18］apo C－I結(jié)構(gòu)、水平與功能的異常與人的脂類代謝失調(diào)的疾病有關(guān)，在高甘油三酯血癥中起著重要的作用，因此apo C－I很可能與肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能是結(jié)核病血清潛在標志物之一。

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