腫瘤壞死因子－α和血漿纖溶酶原激活抑制物－1與動脈粥硬化相關(guān)性研究

林 紅

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 心內(nèi)二科，新疆 烏魯木齊830000）

動脈粥樣硬化主要由于脂肪代謝紊亂和神經(jīng)血管失調(diào)所致，臨床上常伴發(fā)高血壓、高膽固醇血癥或糖尿病相關(guān)癥狀。該疾病多見于40歲以上男性和絕經(jīng)后的女性，并且隨著人們生活水平的提高和生活習(xí)慣不佳，易患人群已經(jīng)呈現(xiàn)出年輕化的趨勢。因此，尋找一種快速有效的診斷方法對于該疾病的早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)顯得尤為重要。臨床上影像學(xué)診斷由于檢測時(shí)間長、費(fèi)用高以及特異性差等缺點(diǎn)而阻礙了動脈粥樣硬化檢查的普及度。而關(guān)于細(xì)胞因子等危險(xiǎn)因子與動脈粥樣硬化的研究有很多。例如總膽固醇、高密度脂蛋白、轉(zhuǎn)錄因子NF－κB、環(huán)氧合酶－2（COX－2）、C 反應(yīng)蛋白、集落刺激因子（CSFs）和TNF－α、PAI－1等均被證明與動脈粥樣硬化具有相關(guān)性。本文旨在探究不同病灶類型的動脈粥樣硬化組織 TNF－α、PAI－1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，揭示組織TNF－α、PAI－1檢測用于動脈粥樣硬化診斷和分型的臨床價(jià)值。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 臨床資料

納入研究的60例動脈粥樣硬化患者均于2010年3月－2011年10月在我院接受動脈粥樣硬化影像學(xué)檢查（X線檢查、動脈造影和多普勒超聲波檢查），其中主動脈粥樣樣硬化12例，冠狀動脈粥樣硬化12例，腦動脈粥樣硬化12例，腎動脈粥樣樣硬化12例，腸系膜動脈粥樣樣硬化12例。按照病灶分型進(jìn)行分組：A組為I型病灶，男5例，女5例，平均年齡（47．3±6．5）歲；B組為Ⅱ型病灶，男6例，女4例，平均年齡（46．3±5．7）歲；C組為Ⅲ型病灶，男5例，女5例，平均年齡（46．7±11．7）歲；D組為Ⅳ型病灶，男5例，女5例，平均年齡（47．3±9．7）歲；E組為V型病灶，男6例，女4例，平均年齡（46．9±6．9）歲；F組為Ⅵ型病灶，男5例，女5例，平均年齡（47．3±6．7）歲。

1．2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)X線檢查、動脈造影和多普勒超聲波檢查所有患者均為不同類型的動脈粥樣硬化患者；②脂蛋白電泳圖形異常；③患動脈粥樣硬化單一疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有動脈粥樣硬化治療經(jīng)歷或動脈粥樣硬化既往病例；②伴發(fā)其他心血管疾病例如腦血栓、冠心病等；③炎癥性動脈疾病，例如多發(fā)性大動脈炎、血栓性閉塞性脈管炎；④伴發(fā)有低熱、血沉增快等炎癥表現(xiàn)；⑤患有自身免疫性疾病、過敏反應(yīng)、炎癥疾病。

1．3 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）

分別抽取所有患者脂肪組織，用博凌科為RNApure高純總RNA快速抽提試劑盒（離心柱型）抽提總mRNA。使用TAKARA公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒擴(kuò)增出總mRNA的cDNA。使用OD260對cDNA進(jìn)行定量。使用表1引物擴(kuò)增TNF－α、PAI－1和β－actin。50μl反應(yīng)體系中含有1 μl cDNA，8μl dNTPs，5μl 10×Buffer（Mg2＋），1μl LA Taq酶，35μlddH2O。然后設(shè)置PCR參數(shù)如下：95℃變性5min，30循環(huán)中95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延長0．5min，最終72℃充分延長10 min。

表1 引物表

1．4 蛋白印跡分析技術(shù)（Western Blot）

分別抽取所有患者脂肪組織，用5×Loading Buffer（TAKARA公司）混勻后在100℃孵育10 min。所有電泳樣品用15%SDS－PAGE電泳，然后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%牛奶（PBST）封閉1h后，一抗稀釋液37℃孵育1h，膜經(jīng)清洗后繼續(xù)用二抗稀釋液37℃孵育1h。使用Amersham ECL（貨號：RPN2109）顯色，使用Bio－Rad凝膠成像儀進(jìn)行拍照和灰度分析。其中TNF－α一抗稀釋液是用10%牛奶按照1∶1000稀釋兔抗人TNF－α的抗體（Cell Signaling，貨號：3707S）；PAI－1一抗稀釋液是用10%牛奶按照1：1000稀釋兔抗人PAI－1的抗體（abcam，貨 號 ab20562）；β－actin 一 抗 稀 釋 液 是 用10%牛奶按照1∶1000稀釋小鼠抗人β－actin的抗體（碧云天，貨號：AA128）。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS12．0軟件計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用（x－±s）表示。計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用χ2和P值表示。P＜0．05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用Pearson相關(guān)分析TNF－α和PAI－1mRNA和蛋白表達(dá)量的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2．1 動脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α和PAI－1mRNA轉(zhuǎn)錄水平

對動 脈 粥 樣 硬 化 脂 肪 組 織 中 TNF－α、PAI－1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行RT－PCR分析發(fā)現(xiàn)，隨著動脈粥樣硬化病灶嚴(yán)重程度增加，TNF－α、PAI－1mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著增加（P均＜0．05），說明TNF－α和PAI－1mRNA轉(zhuǎn)錄水平與動脈粥樣硬化病灶分型具有正相關(guān)性。見圖1。圖1的瓊脂糖電泳圖為6組中選取1個(gè)病例組織的檢測結(jié)果。

2．2 動脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α和PAI－1蛋白表達(dá)情況

對動脈粥樣硬化脂肪組織中TNF－α和PAI－1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行 Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，隨著動脈粥樣硬化病灶嚴(yán)重程度增加，TNF－α、PAI－1表達(dá)水平均顯著增加（P均＞0．05），說明脂肪組織TNF－α、PAI－1蛋白表達(dá)水平與動脈粥樣硬化病灶分型具有正相關(guān)性，見圖2。曲線圖為6組TNF－α和PAI－1與內(nèi)參β－actin灰度比的平均值折線圖。

圖1 動脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α和PAI－1mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖2 動脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α和PAI－1蛋白表達(dá)水平

2．3 動脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α、PAI－1mRNA和蛋白表達(dá)量的相關(guān)性

對6組患者脂肪組織TNF－α和PAI－1mRNA和蛋白表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，隨著患者病灶嚴(yán)重程度增加，TNF－α、PAI－1mRNA 和蛋白表達(dá)量以顯著正相關(guān)性的關(guān)系顯著增加（r＝0．9488，P＜0．01；r＝0．9659，P＜0．01），說明在動脈粥樣硬化病情發(fā)展中，TNF－α、PAI－1mRNA 和蛋白表達(dá)量均會增加，且具有正相關(guān)性。

3 討論

動脈粥樣樣硬化（Atherosclerosis，AS）是心血管病中常見的一種疾病，該疾病從內(nèi)膜動脈病變開始，大量脂質(zhì)和復(fù)合糖類沉積在內(nèi)膜上，導(dǎo)致血栓形成、纖維增生、鈣質(zhì)沉著、動脈中層蛻變和鈣化，使動脈內(nèi)膜脂質(zhì)聚集而造成動脈腔阻塞［1］。導(dǎo)致動脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素包括先天因素和后天因素。先天因素主要是遺傳因素，例如LDL受體基因突變會導(dǎo)致低密度脂蛋白代謝受阻，從而引發(fā)血清中LDL水平升高，LDL的升高是引發(fā)動脈粥樣硬化發(fā)生的必要條件，因此，LDL受體基因突變會誘發(fā)動脈粥樣硬化［2］。除了遺傳因素外，還有后天因素（吸煙、飲食、運(yùn)動、感染、胎兒期環(huán)境、空氣污染等）參與動脈粥樣硬化的發(fā)生。如吸煙會增加血清LDL水平，降低LDL水平［3］；肥胖造成的甘油三酯升高易引發(fā)動脈粥樣樣硬化［4］；久坐的生活習(xí)慣與CAD危險(xiǎn)增加相關(guān)，而經(jīng)常鍛煉則具有保護(hù)作用。

動脈粥樣硬化的發(fā)生會引發(fā)機(jī)體多種因子的異常，主要表現(xiàn)在血清甘油三酯超過1．81mmol／L、膽固醇超過6．76mmol／L時(shí)，高密度脂蛋白顯著升高、低密度脂蛋白（LDL）顯著升高、極低密度脂蛋白（VLDL）顯著升高和脂蛋白 A 顯著升高等［5－7］。除此之外，動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，大量數(shù)據(jù)均證明細(xì)胞因子參與動脈粥樣硬化形成。如血管細(xì)胞粘附分子－1會誘發(fā)血管炎癥反應(yīng)，且巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的組織因子也會參與凝血過程；各種炎癥因子會參與動脈粥樣硬化過程，如 TNF－α、NO、IL－8、IL－6、IL－18和IL－17均參與了動脈粥樣硬化發(fā)生，特別是IL－6被證明是與動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜增厚具有密切聯(lián)系［8，9］。

大量動物實(shí)驗(yàn)均表明TNF－α不僅可以作為動脈粥樣硬化預(yù)測的危險(xiǎn)因子，還可作為動脈粥樣硬化治療療效的評價(jià)指標(biāo)。林秋雄等［10］發(fā)現(xiàn)采用喂食高脂飼料誘導(dǎo)的兔模型血清TNF－α水平顯著高于正常家兔；許耘紅等［11］睡眠剝奪大鼠動脈粥樣樣硬化進(jìn)展大鼠血清TNF－α顯著升高。基于上述研究結(jié)果，研究者已將TNF－α作為動脈粥樣硬化藥物治療療效的評價(jià)方法。例如張志偉等［12］通過血清TNF－α水平探討瑞舒伐他汀治療動脈粥樣樣硬化的療效，經(jīng)瑞舒伐他汀治療后的患者血清TNF－α水平顯著低于治療前，且通過血清TNF－α水平可區(qū)分瑞舒伐他汀和氟伐他汀治療效果。另外，血清TNF－α水平也可用于評價(jià)動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度，例如陳彩霞等［13］比較Ⅱ級和Ⅲ級斑塊血清TNF－α水平顯著高于Ⅰ級斑塊動脈粥樣硬化，且得出血清CRP、TNF－α、IL－6水平增高與頸動脈粥樣樣硬化斑塊嚴(yán)重程度密切相關(guān)的結(jié)論。邵鳳揚(yáng)等發(fā)現(xiàn)纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）的活性與血液纖溶系統(tǒng)密切相關(guān)，且與正組織型纖溶酶原激活物（tPA）的相互作用失衡會造成血栓或出血［14］；陳良華等在家兔模型中研究了卡托普利的藥物作用，治療后的兔模型血清纖溶酶原激活物抑制物－1表達(dá)量顯著低于治療前［15］。

基于上述的研究報(bào)道，我們通過RT－PCR和Western Blot檢測不同病灶類型的動脈粥樣硬化脂肪組織TNF－α、血漿纖溶酶原激活物抑制劑－1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：脂肪組織 TNF－α、PAI－1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平與動脈粥樣硬化病灶分型具有正相關(guān)性，且TNF－α和PAI－1呈正相關(guān)性。由此可見，脂肪組織TNF－α、PAI－1檢測可能具有動脈粥樣硬化病灶分型的診斷價(jià)值。

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