不同照射劑量對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響

賈曉晶，于 雷，邱 玲，馬 巖，王方銳，陳玉丙

（吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院 腫瘤放療科，吉林 長(zhǎng)春130041）

肝癌是我國(guó)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。未接受任何治療的肝癌患者平均生存期只有1～4個(gè)月。該疾病發(fā)生隱匿、病情發(fā)展迅速、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)率高，加之早期診斷困難，就診時(shí)患者常為中晚期，手術(shù)難以切除，所以大部分肝癌病人往往依賴于非手術(shù)治療方法。常用的非手術(shù)治療方法包括肝動(dòng)脈化療加栓塞（TACE）法、無(wú)水酒精注射法、射頻消融以及超聲聚焦治療（HIFU），但療效均不夠理想［1］。

放射治療作為腫瘤的主要治療方式之一已有上百年歷史。近年來(lái)立體定向放射治療（stereotactic radiotherapy，SRT）應(yīng)用于肝癌等惡性腫瘤的臨床治療并取得令人振奮的療效［2－4］。但目前SRT放療技術(shù)，主要是從物理學(xué)角度考慮精確定位和界定靶區(qū)，最大限度地將劑量集中到靶區(qū)，殺滅腫瘤細(xì)胞并盡可能降低靶區(qū)周圍正常組織的照射量，提高腫瘤控制率。事實(shí)上，借助于這種放射物理學(xué)優(yōu)勢(shì)能否達(dá)到預(yù)期的目的，實(shí)現(xiàn)輻射生物效應(yīng)優(yōu)勢(shì)，關(guān)于這一點(diǎn)，目前尚缺乏有力的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本研究探討了不同劑量照射劑量對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)的影響。將為SRT的臨床推廣和應(yīng)用提供重要的放射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑 SMMC7721肝癌細(xì)胞用添加10% 胎牛血清、100uits·mL－1青霉素及100μg·mL－1鏈霉素的（Life Technologies，Inc）DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2的飽和濕度條件下孵育。DMEM培養(yǎng)基 （Invitrogen公司）；胎牛血清（Invitrogen公司）；培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以5×105個(gè)細(xì)胞／孔，接種6孔板。

1．2 照射條件 采用國(guó)產(chǎn)X射線深部治療機(jī)進(jìn)行照射，200kV，10mA，濾板0．5mmCu和1．0mm Al，源靶距50cm，吸收劑量率0．287Gy·min－1。細(xì)胞完全貼壁后，分為7組，分別給予0（假照組）、0．5、1、2、4、6、8Gy照射。

1．3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 分別取各不同劑量照射組細(xì)胞各200個(gè)，接種于直徑60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，每組細(xì)胞接種3個(gè)培養(yǎng)皿，于CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)7～10 d，1%甲基藍(lán)對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞染色，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)大于50的克隆數(shù)。細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF）按公式計(jì)算：

SF（%）＝ （NX／N0）×100%，

其中NX為細(xì)胞克隆數(shù)，N0為接種細(xì)胞數(shù)。

1．4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將肝癌細(xì)胞SMMC7721以5×105個(gè)細(xì)胞／孔，接種6孔板，分7組，接種細(xì)胞24 h后分別接受0、0．5、1、2、4、6、8Gy X 線照射。照射后12h，收集細(xì)胞，給予AnnexinⅤ 和PI雙染、然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同輻射劑量對(duì)肝癌細(xì)胞早期凋亡的影響。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)資料用SPSS 15．0軟件包（SPSS Inc，Chicago，IL）建立數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，用單向方差分析對(duì)多組均值進(jìn)行比較。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2．1 不同輻射劑量對(duì)肝癌細(xì)胞生存率的影響

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同劑量0、0．5、1、2、4、6和8Gy照射組中，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)見表1。

表1 不同輻射劑量對(duì)肝癌細(xì)胞生存率的影響

2．2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 見表2。

表2 不同輻射劑量對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

放射治療作為腫瘤的主要治療方式之一，已有上百年歷史。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前約有2／3的惡性腫瘤病人在其病程的某一階段可接受根治性或姑息性放療。傳統(tǒng)放療方法由于受技術(shù)限制，不能把劑量都集中到靶區(qū)，靶區(qū)定位和界定精度較差，在給予腫瘤高劑量照射的同時(shí)也使旁鄰正常組織受到過(guò)量照射，易引起較嚴(yán)重的急性和遠(yuǎn)期并發(fā)癥。這不僅限制了腫瘤治療的有效劑量，也明顯降低了患者的生活質(zhì)量［5－7］。

近年來(lái)，隨著放療技術(shù)和設(shè)備的突飛猛進(jìn)的發(fā)展，立體定向放射治療（stereotactic radiotherapy－SRT）開始應(yīng)用于肝癌等惡性腫瘤的臨床治療。SRT根據(jù)單次劑量的大小和射野集束的程度，可分為兩類：一類SRT的特點(diǎn)是使用小野三維集束分次大劑量照射（γ－刀、X－刀）；另一類SRT是利用立體定向技術(shù)進(jìn)行常規(guī)分次的放射治療（三維適形放療、調(diào)強(qiáng)適形放療）。SRT定位、佰位精度高，可利用三維治療計(jì)劃系統(tǒng)，確定SRT的射線束方向，精確地計(jì)算并優(yōu)化病變和鄰近重要組織器官的劑量分布。這樣多個(gè)小野三維集束定向照射，周圍正常組織受量很小，而射線對(duì)病變起到類似手術(shù)的作用。因此，SRT技術(shù)的應(yīng)用即可嚴(yán)格保護(hù)鄰近重要器官，又可使病變靶區(qū)部位得到大劑量的照射［8，9］。

SRT治療肝癌即充分發(fā)揮了三維空間的聚焦優(yōu)勢(shì)，通過(guò)共面或非共面等中心照射技術(shù)，采用多方位、多射束入射，使放射線集中至與腫瘤空間形態(tài)一致的靶區(qū)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)精確照射，從而減少靶區(qū)周圍正常組織的受照劑量，同時(shí)能避開靶區(qū)周圍重要器官，使靶區(qū)處方劑量的進(jìn)一步提高成為可能。為提高腫瘤局部控制率，避免或減輕肝臟的放射性損傷提供了有力的技術(shù)保證。低分割單次大劑量照射同時(shí)也相應(yīng)縮短了療程，為腫瘤的綜合治療贏得了寶貴的時(shí)間和機(jī)會(huì)。目前SRT在肝癌的放射治療中已經(jīng)獲得了廣泛應(yīng)用并取得了一定的療效，但目前SRT放療技術(shù)，主要是從物理學(xué)角度考慮精確定位和界定靶區(qū)，最大限度地將劑量集中到靶區(qū)，殺滅腫瘤細(xì)胞并盡可能降低靶區(qū)周圍正常組織的照射量，以提高TGF，提高腫瘤控制率。事實(shí)上，借助于這種放射物理學(xué)優(yōu)勢(shì)能否達(dá)到預(yù)期的目的，從而實(shí)現(xiàn)輻射生物效應(yīng)優(yōu)勢(shì)，關(guān)于這一點(diǎn)，目前尚缺乏有力的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)探討了不同輻射劑量對(duì)肝癌細(xì)胞生存率和細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在不同劑量0、0．5、1、2、4、6和8Gy照射組中，細(xì)胞細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)隨著照射劑量的增加而減少。與0．5Gy和1Gy組相比，2、4、6、8Gy照射組的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯減低（P＜0．05）。而0．5Gy和1Gy照射組之間無(wú)顯著差異。2、4、6Gy組之間比較無(wú)顯著差異。而8Gy照射組的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯低于任何其他組（P＜0．05）。在0、0．5、1、4、6和8Gy照射組中，隨著照射劑量的增加細(xì)胞凋亡比率明顯增加。因此照射劑量是影響細(xì)胞生存率和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的重要因素。因此，提高放療照射劑量可以明顯在體外影響肝癌細(xì)胞的存活，增加細(xì)胞凋亡。提高單次照射劑量，大分割照射模式能夠明顯提高腫瘤殺傷效應(yīng)。因此，立體定向放療的單次大劑量分割照射模式是可以達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的臨床生物效應(yīng)的，與常規(guī)2Gy等小劑量相比較，細(xì)胞殺傷效果更為顯著。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較SRT放療與常規(guī)放療模式輻射生物效應(yīng)的差別，將為SRT的臨床推廣和應(yīng)用提供重要的放射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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