耐亞安培南的銅綠假單胞菌OprD2的缺失與金屬β－內酰胺酶編碼基因的研究

郝維敏

（宿州市立醫院 檢驗科，安徽 宿州234000）

銅綠假單胞菌是醫院感染的常見致病菌，免疫力低下的患者可引起嚴重的呼吸機相關性肺炎、敗血癥、燒傷創面和泌尿系統感染等，在臨床抗感染治療中，容易對臨床常用的抗生素產生耐藥，且耐藥機制復雜。亞胺培南曾經是銅綠假單胞菌治療的有效藥物［1］，但隨著亞胺培南的廣泛應用，其敏感性逐年下降。研究表明，亞胺培南進入細菌的通道蛋白OprD2的缺失，染色體介導的頭孢菌素酶的產生，非特異性藥物的主動外排系統和產金屬β－內酰胺酶都可以導致銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥［2，3］。為了解本院耐亞胺培南的銅綠假單胞菌中外膜蛋白OprD2的缺失及產金屬β－內酰胺酶（MBLs）菌株編碼基因的攜帶情況，我們收集了本院2009年1月—2010年1月所有耐亞胺培南的銅綠假單胞菌的臨床分離株，并對這些菌株的OprD2的缺失及產金屬β－內酰胺酶菌株的編碼基因進行了研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株來源 收集本院2009年1月—2010年4月臨床分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌76株，所有重復菌株均排除在外。76株不重復菌株分別分離自痰標本（58株），傷口分泌物（18株），尿標本（4株），血培養（3株），其他標本（3株）。76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌分別來自ICU38株，干部病房15株，外科病區10株，呼吸科6株，泌尿科4株，感染科3株。標準質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853購自衛生部臨檢中心，產IMP和VIM型金屬酶的菌株由安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科細菌室惠贈。

1．2 檢測方法

1．2．1 儀器試劑 法國梅里埃公司的VITER32全自動微生物分析儀，PCR擴增儀為美國PE公司產品，電泳儀為北京六一儀器廠生產，紫外凝膠電泳成像系統由安徽醫科大學第一附屬醫院提供。MH瓊脂和亞胺培南藥敏紙片購自Oxoid公司，EDTA購自Sigma公司，PCR的Master試劑購自上海生物工程公司，引物合成序列由分析由上海生物工程公司合成。

1．2．2 細菌鑒定及藥敏試驗 用VITER32全自動微生物分析儀配套的鑒定卡將細菌鑒到種，瓊脂稀釋法測定76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度（MIC），按美國實驗室標準化委員會（CLSI）的最新推薦標準判定結果。

1．2．3 產MBLs菌株篩選 采用亞胺培南－EDTA紙片增效法進行檢測。按照標準紙片擴散法藥敏試驗操作規程，在M－H平板上涂抹待檢菌，分別貼2張IMP藥敏紙片，紙片間距為30－40mm，其中一張IMP紙片加EDTA溶液15ml，37℃孵育24小時，加EDTA紙片抑菌圈直徑比不加EDTA紙片抑菌圈直徑≥7mm為MBLs陽性。

1．2．4 PCR耐藥基因的檢測 擴增用模板制備采用煮沸法。反應總體積為50μl。檢測OprD2的基因 （F 5′－GGAATAGAGTGGCTTAATTCTC，R 5′－GCCACGCGATTTGACGGAG 193bp），IMP型基因（F 5′－TTTCATAGCGACAGCACG，R 5′－TGCGTCTCCAACTTCACTG 378bp）、VIM 型（F 5′－TCCGACAGTCAGCGAAAT， R 5′－GCAGCACCAGGATAGAAGA 435bp）、金屬β－內酰胺酶的引物由上海生工公司合成。

檢測OprD2基因的反應條件為93℃3min預變性，93℃1min、55℃1min，72℃1min循環35次，最后，72℃5min充分延伸。檢測MBLs各基因的反應條件為：先94℃4min預變性，然后94℃1min、55℃1min、72℃1．5min循環25次，最后72℃10 min充分延伸。PCR產物經0．8%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。

1．2．5 數據分析 用 WHONET5．3軟件對細菌的MIC結果進行耐藥性分析。

2 結果

2．1 藥敏試驗結果 76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌藥敏試驗結果見表1。

表1 76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌藥敏試驗結果

2．2 OprD2基因的檢測結果 經PCR擴增OprD2基因發現：76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌中19株（25%）表達OprD2的基因，其余57株（75%）OprD2基因缺失，見圖1。

2．3 MBLs及其基因檢測結果 本次實驗收集的76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌經亞胺培南—EDTA紙片增效試驗檢出16（21．1%）株產 MBLs，經過基因擴增試驗證實，其中13株攜帶VIM型基因，另3株攜帶IMP型基因，VIM、IMP陽性擴增產物經上海生工公司測序后，證實分別為 VIM－2和IMP－1型 MBLs．（見圖2、3）。16株產 MBLs的菌株都存在孔蛋白通道OprD2的缺失。

圖1 OprD2膜孔蛋白基因檢測結果

3 討論

本研究選用的76株銅綠假單胞菌除對亞胺培南耐藥外，對其它抗生素均有較高的耐藥性，其中氨曲南耐藥率達73．7%，環丙沙星達53．9%，慶大霉素達94．7%，頭孢他啶達43．4%。

圖2 MBLs陽性結果

目前有關耐亞胺培南的銅綠假單胞菌的耐藥機制主要涉及到高產AmpC酶、金屬β－內酰胺酶的水解、藥物的主動排除和外膜蛋白OprD2的減少或缺失［4］。通常外膜蛋白OprD2基因缺乏是介導銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要機制［5］，因為亞胺培南是分子量較小的親水性β－內酰胺類藥物，可以通過細菌外膜上具有通透性功能的外膜蛋白OprC、OprD2、OprE擴散，但OprD2是亞胺培南通過的特異性通道［6］，本院76株分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌中，OprD2基因缺失51株，缺失率達75%，表明外膜蛋白中OprD2的表達缺乏在我院臨床分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌中存在，是主要的耐藥機制。

金屬β－內酰胺酶主要有IMP型和VIM型，近年來又發現SPM－1型和GIM－1型等類型，能滅活青霉素類，頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素，但對氨曲南無水解活性，可被EDTA等金屬螯合劑抑制，但不被β－內酰胺酶抑制劑克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦抑制［7］，所以我院分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌對氨芐西林／舒巴坦的耐藥率為100%。我院分離的76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌產MBLs16株，其中 VIM－2型13株，IMP－1型3株，表明我院存在產VIM－2型和IMP－1型MBLs菌株的流行。VIM－2型基因主要存在染色體上［6］，僅少數存在質粒上。而IMP－1基因大多位于質粒上，但它們多數位于Ⅰ類整合子結構中，常同時攜帶氨基糖苷類耐藥基因，所以成多重耐藥，醫院環境中出現的產MBLs的銅綠假單胞菌給臨床治療帶來極大的困難，同時也是感染控制部門面臨的一個嚴峻的問題。產MBLs菌株的準確檢測和報導對于阻止多重耐藥菌的蔓延起到非常重要的作用。本次分離的16株產MBLs的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌，OprD2基因全部缺失，表明臨床分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌存在多重耐藥機制。因此，我們建議所有臨床分離的銅綠假單胞菌都應常規進行OprD2基因和產MBLs的檢測，減少碳青霉烯類抗生素的不合理使用，從而防止醫院內耐藥菌的傳播。

［1］王 晶，韓麗霞．耐亞胺培南銅綠假單胞菌的β－內酰胺酶類耐藥基因研究［J］．大連醫科大學報，2009，31（5）：583．

［2］徐元宏，沈繼錄，楊佰俠，等．產金屬酶合并外膜蛋白缺失的銅綠假單胞菌的檢測［J］．中華醫院感染學雜志，2005，15（10）：1085．

［3］WangC，WangJ，MiZ．Pseudomonas aeruginosa producing VIM－2 metallo beta－lactamases and carrying two aminoglycoside－modifying enzymes in China［J］．Hosp Infect，2006，62（4）：522．

［4］Quale J，Bratu S，Gupta J，etal．Interplay of efflux system，ampC，and oprD expression in carbapenem resistance of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates ［J］．Antimicrob Agents Chemother，2006，50（5）：1633．

［5］Diallo Mamadou Cherif，魏殿軍，曹 陽，等．耐亞胺培南銅綠假單胞菌oprD2基因與金屬酶的檢測［J］．中華感染與化療雜志，2008，8（5）：369．

［6］熊 薇，王洪波，徐 敏，等．銅綠假單胞菌外膜蛋白OprD2缺乏和金屬β－內酰胺酶與亞胺培南耐藥的關系［J］．中華醫院感染學雜志，2007，17（10）：1193．

［7］甘曉玲銅綠假單胞菌對碳青霉稀類抗生素的多重耐藥機制［J］．重慶醫學，2008，37（16）：1851．