間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)臍血造血干／祖細(xì)胞體外擴(kuò)增效力的影響

遲 玥，段海峰，于 庭＊

（1．吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射研究所，北京100850）

近年來(lái)，臍血造血干細(xì)胞（HSCs）移植倍受關(guān)注，但由于臍血中HSCs數(shù)量不足以及輸注后產(chǎn)生的成熟細(xì)胞生物動(dòng)力欠佳等因素，使臍血HSCs移植的應(yīng)用受到了限制。因此，許多學(xué)者致力于HSCs體外擴(kuò)增的研究，尋求適宜的HSCs體外擴(kuò)增環(huán)境，提高臍血HSCs質(zhì)量成為亟待解決的問題。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是最早發(fā)現(xiàn)于骨髓基質(zhì)中的一種多能干細(xì)胞，它具有多向分化潛能、能形成有利于HSCs生長(zhǎng)的微環(huán)境［1］，可以分泌與 HSCs生長(zhǎng)相關(guān)的黏附分子、細(xì)胞外基質(zhì)和多種細(xì)胞因子［2］，支持造血并促進(jìn)HSCs體內(nèi)植入。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，近期發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞也是構(gòu)成HSCs微環(huán)境的成員之一，并通過分泌干細(xì)胞因子（SCF）等多種因子影響HSCs的增殖和自我更新［3］。此外已有研究表明，人臍帶沃頓膠中分離出的MSCs可衍生為EPCs［4］，EPCs可分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)MSCs的活性［5］，并且MSCs與EPCs可互為對(duì)方的生長(zhǎng)微環(huán)境，影響對(duì)方細(xì)胞的增殖和分化［6］。故MSCs、EPCs以及HSCs三者的關(guān)系是近年研究的熱點(diǎn)和趨勢(shì)。

雖然目前國(guó)內(nèi)外已分別研究了MSCs及EPCs對(duì)HSCs體外擴(kuò)增的影響，但尚未闡明兩者對(duì)HSCs作用的差異性。因此，本研究通過將MSCs、EPCs作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，與HSCs／HPCs接觸共培養(yǎng)，比較兩者對(duì)HSCs／HPCs擴(kuò)增能力、表面抗原CD34的表達(dá)以及集落形成能力的作用差異性，為尋求一個(gè)更適合HSCs體外大量擴(kuò)增的微環(huán)境奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)胞和臍帶血 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射研究所分離及鑒定；內(nèi)皮祖細(xì)胞由解放軍307醫(yī)院CTC中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；臍血由北京中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院產(chǎn)科提供。

1．1．2 試劑 甲基纖維素、胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品；人淋巴細(xì)胞分離液為天津TBD公司產(chǎn)品；胎牛血清、臺(tái)盼藍(lán)染液為Gibco公司產(chǎn)品；Iscovo’s Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）、Minimum Essential Medium Alpha Medium（α－MEM）為Invitrogen 公 司 產(chǎn) 品；Endothelial Cell Medium（ECM）為Sciencell公司產(chǎn)品；絲裂霉素C（mitomycin C）為INALCO公司產(chǎn)品；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基（MethoCultTMH4434）為 StemCell Technologies公司產(chǎn)品；抗人CD34－PE、抗人CD45－FITC為BD pharmingen公司產(chǎn)品；EDTA為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司產(chǎn)品；HEPES為Ameresco公司產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 臍帶血MNCs的分離和鑒定 無(wú)菌采集健康產(chǎn)婦足月妊娠的臍血標(biāo)本，當(dāng)日分離。以臍血：PBS：0．5%甲基纖維素＝1∶3∶1的比例混合。室溫靜置30min。小心吸取上清離心，1 600rpm，10 min，22℃，得有核細(xì)胞。所得有核細(xì)胞用10倍以上體積 PBS洗滌一次，離心，1 500rpm，6min，22℃。重懸于5ml PBS，混勻。在15ml離心管底部加入5－10ml人淋巴細(xì)胞分離液，將細(xì)胞懸液小心加入其上。離心1 500rpm，30min，22℃。小心取出離心管，溶液分為3層：從上至下依次是透明的PBS層，單個(gè)核細(xì)胞層，紅細(xì)胞層。吸出單個(gè)核細(xì)胞層，加入30ml PBS混勻，1 500rpm，5min離心洗滌；再用10ml PBS同條件離心再洗滌一次。棄上清后沉淀為所需MNCs，為共培養(yǎng)和鑒定備用。

計(jì)數(shù)后，用抗人CD34－PE和抗人 CD45－FITC雙色標(biāo)記106個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)其中CD34＋CD45－的細(xì)胞所占比例。

1．2．2 滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備 4－6代 MSCs接種在含α－MEM（含人血小板裂解物［7］）培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，于溫度為37℃，CO2濃度為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至80%－90%融合時(shí)，0．05%胰蛋白酶消化傳代，細(xì)胞鋪于6孔板（Corning公司）中的兩個(gè)孔，每孔2×105個(gè)細(xì)胞。加入2mlα－MEM培養(yǎng)液按上述條件培養(yǎng)至80%－90%融合。吸出培養(yǎng)基后，每孔用無(wú)血清IMDM洗兩次，加入終濃度為10μg／ml的絲裂霉素C，于溫度為37℃，CO2濃度為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2．5h，無(wú)血清IMDM洗3次，作為MSCs滋養(yǎng)層備用［8］。

4－6代EPCs接種在含ECM完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，于溫度為37℃，CO2濃度為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至80%－90%融合時(shí)，0．05%胰蛋白酶消化傳代，細(xì)胞鋪于6孔板中的兩個(gè)孔，每孔2×105個(gè)細(xì)胞。加入2ml ECM培養(yǎng)液按上述條件培養(yǎng)至80%－90%融合。吸出培養(yǎng)基后，每孔用無(wú)血清IMDM洗兩次，加入終濃度為2．5μg／ml的絲裂霉素C，于溫度為37℃，CO2濃度為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2．5h，無(wú)血清IMDM洗3次，作為EPCs滋養(yǎng)層備用。

1．2．3 MSCs和EPCs分別與 MNCs共培養(yǎng) 共培養(yǎng)分為3組：對(duì)照組（無(wú)滋養(yǎng)層），MSC組（MSC細(xì)胞滋養(yǎng)層），EPC組（EPC細(xì)胞滋養(yǎng)層），每組2個(gè)復(fù)孔。加入新分離的 MNC105個(gè)細(xì)胞／孔，每孔加入2ml含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基。共培養(yǎng)2－3d半換液一次，并將所有 MNCs轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的絲裂霉素C處理后的滋養(yǎng)層繼續(xù)培養(yǎng)。分別在共培養(yǎng)第0d、4d、7d觀察顯微鏡下每孔細(xì)胞增殖情況并拍照，并用4%臺(tái)盼藍(lán)染液以1∶1比例染色后計(jì)數(shù)每孔活細(xì)胞數(shù)。

1．2．4 流式細(xì)胞術(shù)分析 吸出共培養(yǎng)7d后的各孔細(xì)胞，用抗人CD34－PE和抗人CD45－FITC抗體雙色標(biāo)記細(xì)胞，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組MNCs的CD34＋CD45－細(xì)胞所占比例。每組各設(shè)一個(gè)對(duì)照管和一個(gè)樣本管。

1．2．5 造血祖細(xì)胞集落分析 實(shí)驗(yàn)共設(shè)3組：第一組為臍血中新分出的MNCs；第二組為共培養(yǎng)4d后，對(duì)照組（無(wú)滋養(yǎng)層），MSC組（MSC細(xì)胞滋養(yǎng)層），EPC組（EPC細(xì)胞滋養(yǎng)層）中的MNCs，第3組為共培養(yǎng)7d后，對(duì)照組（無(wú)滋養(yǎng)層），MSC組（MSC細(xì)胞滋養(yǎng)層），EPC組（EPC細(xì)胞滋養(yǎng)層）中的MNCs。共培養(yǎng)后的7組MNCs均以2×105／ml的密度接種于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，每組3個(gè)復(fù)孔，于溫度為37℃，CO2濃度為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7－10d后觀察集落生長(zhǎng)情況，計(jì)數(shù)3組每個(gè)孔 CFU－E，BFU－E，CFU－GEMM，CFU－GM，CFU－G和CFU－M的總集落數(shù)，并進(jìn)行比較。

1．2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 多組計(jì)量資料的比較，采用方差分析的兩兩比較。

2 結(jié)果

2．1 共培養(yǎng)過程中，3組MNCs的擴(kuò)增情況和擴(kuò)增倍數(shù)的比較

圖1－1 共培養(yǎng)過程中3組MNCs的擴(kuò)增情況

圖1－1結(jié)果所示，本組內(nèi)部比較，對(duì)照組、MSC組、EPC組的擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)在第4天、第7天均較第0天呈增加趨勢(shì)。同時(shí)，第4天和第7天MSC組、EPC組的擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組為多，且EPC組的細(xì)胞數(shù)增加更明顯。

圖1－2 共培養(yǎng)過程中三組MNCs擴(kuò)增倍數(shù)的比較

圖1－2結(jié)果所示，共培養(yǎng)第4天，MSC組擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)約為對(duì)照組的1．71倍（＊＊，P＜0．01），EPC組擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)約為對(duì)照組的2．93倍（＊，P＜0．05），EPC組擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)約為 MSC組的1．57倍但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共培養(yǎng)第7天，MSC組擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)約為對(duì)照組的1．38倍（＊，P＜0．05），EPC組擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)約為對(duì)照組的2．10倍（＊＊，P＜0．01），EPC組擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)約為 MSC組的1．53倍（＊＊，P＜0．01）。共培養(yǎng)第4天與第0天比較，對(duì)照組擴(kuò)增倍數(shù)約為2．025（＊＊，P＜0．01），MSC組擴(kuò)增倍數(shù)約為3．775（＊＊，P＜0．01），EPC組擴(kuò)增倍數(shù)約為5．925（＊，P＜0．05）；共培養(yǎng)第7天與第0天比較，對(duì)照組擴(kuò)增倍數(shù)約為3．975（＊＊，P＜0．01），MSC 組擴(kuò)增倍數(shù)約為 5．475（＊＊，P＜0．01），EPC 組擴(kuò)增倍數(shù)約為 8．350（＊＊，P＜0．01）；共培養(yǎng)第7天與第4天比較，對(duì)照組擴(kuò)增倍數(shù)約為1．96（＊＊，P＜0．01），MSC組擴(kuò)增倍數(shù)約為1．45（＊，P＜0．05），EPC 組擴(kuò)增倍數(shù)約為1．41（＊，P＜0．05）。

2．2 流式細(xì)胞術(shù)分析擴(kuò)增前后CD34＋CD45－的HSCs／HPCs比例的變化

圖2－1結(jié)果所示，擴(kuò)增前CD34＋CD45－的HSCs／HPCs占MNCs的2．20%。

圖2－2結(jié)果所示，共培養(yǎng)7天后，對(duì)照組CD34＋CD45－的HSCs／HPCs占 MNCs的1．40%；MSC組CD34＋CD45－的 HSCs／HPCs占 MNCs的1．85%；EPC組CD34＋CD45－的 HSCs／HPCs占 MNCs的0．41%。

圖2－3結(jié)果所示，共培養(yǎng)7天后，3組MNCs中CD34＋CD45－的HSCs／HPCs比例均較擴(kuò)增前明顯下降。其中，MSC組CD34＋CD45－的 HSCs／HPCs所占比例下降幅度沒有對(duì)照組顯著，而EPC組CD34＋CD45－的HSCs／HPCs所占比例較對(duì)照組下降更顯著。

2．3 共培養(yǎng)過程中，3組HSCs／HPCs集落形成能力的分析

圖2－1 擴(kuò)增前HSCs／HPCs表面抗原CD34／CD45

圖2－2 共培養(yǎng)7d后3組HSCs／HPCs表面抗原CD34／CD45

圖2－3 共培養(yǎng)過程中HSCs／HPCs CD34表達(dá)的變化情況

圖3 共培養(yǎng)過程中3組HSCs／HPCs集落形成能力的分析

如圖3所示，共培養(yǎng)第4天和第7天，對(duì)照組和EPC組的HSCs／HPCs集落形成總數(shù)均較擴(kuò)增前明顯下降，MSC組的HSCs／HPCs集落形成總數(shù)則呈增加趨勢(shì)。

共培養(yǎng)第4天的HSCs／HPCs，MSC組的集落形成總數(shù)為對(duì)照組的2．55倍（＊＊，P＜0．01），為EPC組的2．47倍（＊＊，P＜0．01）；共培養(yǎng)第7天的HSCs／HPCs，MSC組的集落形成總數(shù)為對(duì)照組的3．73倍（＊＊，P＜0．01），為EPC組的3．45倍（＊＊，P＜0．01）；共培養(yǎng)第4天與第7天的HSCs／HPCs，EPC組與對(duì)照組的集落形成總數(shù)均無(wú)顯著差異。

3 討論

本研究中，為形成與HSCs／HPCs體內(nèi)生長(zhǎng)相似的細(xì)胞微環(huán)境，我們并未將分離出的MNCs再次篩選獲得純度較高的CD34＋細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而采用絲裂霉素C分別處理MSCs和EPCs以抑制其分裂增殖，制備滋養(yǎng)層細(xì)胞后，將新鮮臍血中分離的MNCs分別接種于2種滋養(yǎng)層細(xì)胞和僅有培養(yǎng)基的3種環(huán)境中進(jìn)行接觸共培養(yǎng)，以7天為一個(gè)周期。通過對(duì)共培養(yǎng)體系的鏡下觀察和臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，3組MNCs數(shù)均隨時(shí)間變化而增加，以EPC組MNCs增加最顯著，MSC組次之。

為確定增加的MNCs中HSCs／HPCs的數(shù)量，我們從HSCs特征性表面抗原CD34的檢測(cè)和HSCs／HPCs特有的集落形成能力這兩個(gè)方面進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可維持HSCs／HPCs表面抗原CD34的存在，且可從數(shù)量和集落大小兩個(gè)方面增強(qiáng)HSCs／HPCs的集落形成能力；而EPCs雖然使 MNCs總數(shù)顯著增加，但其中的CD34＋CD45－的HSCs／HPCs比例明顯下降，且在改變HSCs／HPCs的集落形成能力上無(wú)顯著作用。其中，MSCs對(duì)HSCs／HPCs的擴(kuò)增作用可能與其分泌的多種細(xì)胞因子，以及多因子參與的信號(hào)通路有關(guān)［9］，如 Wnt［10］、Notch［6］；而 EPCs分泌的細(xì)胞因子及蛋白雖可增加細(xì)胞數(shù)量，但可能導(dǎo)致多潛能HSCs／HPCs選擇性擴(kuò)增和終末分化，從而促進(jìn)CD34＋細(xì)胞系特異性分化，并可能降低 HSCs／HPCs在骨髓內(nèi)歸巢的能力［11］。因此，后續(xù)研究可分析MSCs與EPCs分泌的因子差異，從機(jī)制上探討影響HSCs／HPCs體外擴(kuò)增的可能關(guān)鍵因素。同時(shí)由于MSCs一定條件下可衍生為EPCs，且EPCs可分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)MSCs的活性，故后續(xù)研究也可嘗試將兩種細(xì)胞同時(shí)置于HSCs／HPCs體外擴(kuò)增的微環(huán)境中，探討其共同作用及機(jī)制。

總之，本研究結(jié)果顯示，MSCs和EPCs均可促進(jìn) HSCs／HPCs的體外擴(kuò)增，提供適合 HSCs／HPCs生長(zhǎng)的微環(huán)境。MSCs可有效促進(jìn)HSCs／HPCs的體外擴(kuò)增，并保持其造血重建潛能和歸巢能力；而EPCs僅可增加擴(kuò)增體系中的細(xì)胞總數(shù)，卻不能維持 HSCs／HPCs的造血潛能，可能與促進(jìn)HSCs／HPCs向成熟造血細(xì)胞分化有關(guān)。

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