嘌呤核苷酸對海洛因依賴及戒斷大鼠垂體嘌呤核苷酸代謝關鍵酶基因表達的影響

崔佳樂，洪新雨，趙麗艷，，劉劍凱，洪 敏＊

（1．吉林大學白求恩醫學院 組織學與胚胎學教研室，吉林 長春130021；

2．吉林大學第一醫院 神經外科，吉林 長春130021；3．吉林大學第二醫院 檢驗科，吉林 長春130041；4．吉林大學白求恩醫學院 生物化學與分子生物學教研室，吉林 長春130021）

毒品的濫用成癮是嚴重的醫學和社會問題，海洛因是具有代表性的阿片類毒品，對機體多個系統的器官都有較嚴重的毒性和潛在的危害［1，2］，神經系統常受損嚴重。以往的研究表明海洛因可造成機體嘌呤核苷酸的分解代謝增強，表現為血尿酸明顯增高［3］，并且發現阿片類藥物使大鼠大部分組織器官中次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT）的基因表達下降，同時給予腺苷或嘌呤核苷酸則可逆轉或緩解阿片類物質所致的某些損害［4－6］。有學者報道ATP和它的代謝產物通過激活腺苷和／或嘌呤受體而調節下丘腦功能，這些受體表達在神經內分泌細胞和內分泌細胞，包括下丘腦神經元，有分泌作用的垂體細胞和支持細胞［7］。這些都提示核苷酸的代謝情況會與海洛因成癮及戒斷情況下垂體的功能狀態密切相關。本文通過檢測海洛因成癮、戒斷及補償嘌呤核苷酸大鼠垂體嘌呤核苷酸代謝關鍵酶基因表達情況的變化，觀察海洛因對嘌呤核苷酸代謝的影響，及嘌呤核苷酸的治療干預作用，為探討補償嘌呤核苷酸作為海洛因戒癮的新療法及其將來應用于臨床提供依據。

1 材料與方法

1．1 動物、藥品及試劑

實驗選用清潔級健康成年雄性Wistar大鼠80只，體重為200±20g，由吉林大學實驗動物中心提供（動物合格證號：吉檢證字第2003－0001號）。海洛因（純度98%）由吉林省公安廳禁毒辦公室提供，臨用時用生理鹽水溶解、抽濾除菌。嘌呤核苷酸：腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP），鳥苷一磷酸（guanosine monophosphate，GMP）為 AMRESCO公司產品。PCR引物：特異引物由賽百盛基因技術有限公司合成，引物設計根據Primer 5．0設計軟件完成。β－肌動蛋白Ⅰ（β－actinⅠ）擴增產物長度為511bp，上游引物：5′－GAAATCGTGCGTGACATTAA－3′， 下 游 引 物：5′－CTAGAAGCATTTGCGGTGCA－3′；β－肌動蛋白Ⅱ（β－actinⅡ）擴增產物長度為218bp，上游引物：5′－AAGAGAGGCATCCTGACCCT－3′，下 游 引 物：5′－TACATGGCTGGGGTGTTGAA－3′；ADA 引物擴增產物長度 為 258bp，上 游 引 物：5′－GCAACATTATCGGCATGGAC－3′，下 游 引 物：5′－CAAGATCCACAACCTCATCAG－3′；HGPRT引物擴增產物長度為410bp，上游引物：5′－GCTGACCTGCTGGATTACATTA－3′，下 游 引 物：5′－CCACTTTCGCTGATGACACAA－3′。

1．2 動物分組與給藥

80只雄性Wistar大鼠隨機分成8組，每組10只，喂食普通固體飼料，自由飲水，同條件飼養，自然晝夜采光。①對照組（C）：第1－10天每日2次腹腔注射生理鹽水，注射體積及時間與當日海洛因給藥體積及時間相同，第11天處死。②核苷酸組（N）：第1－10天每日2次（AM7：00和PM19：00）腹腔注射核苷酸（AMP與GMP等摩爾混合），每日次劑量均為7．5mg·kg－1體重，第11天處死。③海洛因組（H）：第1－10天每日2次（AM7：00和PM19：00）腹腔注射海洛因，每日次劑量依次為0．50、0．75、1．25、2．00、3．00、4．25、5．75、7．50、7．50和7．50mg·kg－1體重，第11天處死。④海洛因＋核苷酸組（NH）：第1－10天每日2次（AM7：00和PM19：00）腹腔注射核苷酸和海洛因（核苷酸劑量同當日核苷酸組，海洛因劑量同當日海洛因組），第11天處死。⑤海洛因戒斷3d組（W3）：第1－10天每日2次腹腔注射海洛因（同海洛因組），第11－13天停藥，第14天處死。⑥海洛因戒斷9d組（W9）：第1－10天每日2次腹腔注射海洛因（同海洛因組），第11－19天停藥，第20天處死。⑦核苷酸3d組（N3）：第1－10天每日2次腹腔注射海洛因（同海洛因組），第11－13天每日2次腹腔注射核苷酸（給藥劑量及時間同核苷酸組），第14天處死。⑧核苷酸9d組（N9）：第1－10天每日2次腹腔注射海洛因（同海洛因組），第11－19天每日2次腹腔注射核苷酸（給藥劑量及時間同核苷酸組），第20天處死。

1．3 RT－PCR法檢測垂體組織的 ADA mRNA和HGPRT mRNA含量

異硫氰酸胍法提取大鼠垂體組織的總RNA，經逆轉錄獲得cDNA。PCR反應在0．2ml Eppendorf管中建立反應混合物包括：10×PCR Buffer 5μl，dNTP（10mmol·L－1）1μl，β－actin上下游引物各10pmol，ADA和HGPRT的PCR反應上下游引物（ADA的PCR反應上下游引物各50pmol，HGPRT的PCR反應上下游引物各10pmol），cDNA 1 μl，Taq DNA聚合酶（5U·μl－1）0．5μl，加三蒸水補足體積至50μl。ADA擴增的PCR反應條件：①95℃，3min；②95℃，35s；③64℃，1min；④72℃，1 min；⑤重復步驟②－④，34個循環；⑥72℃，10 min。HGPRT擴增的PCR反應條件：①95℃，3 min；②95℃，35sec；③58℃，1min；④72℃，1min；⑤重復步驟②－④，27個循環；⑥72℃，10min。RT－PCR產物的定量鑒定：PCR產物在1．5%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色后用Kodak凝膠電泳呈像分析系統進行電泳結果的拍照及電泳條帶的強度分析，分別計算每一條泳道的目地基因擴增產物與內參β－actin擴增產物的強度比值，表示該目的基因的相對表達水平。

1．4 統計學分析

采用SPSS 8．0統計軟件，垂體組織的ADA mRNA及HGPRT mRNA含量以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2．1 各組大鼠垂體組織中ADA基因表達水平

與對照組比較，海洛因組、戒斷3d組大鼠垂體ADA mRNA相對表達量數值上有所增高，但各組均未見明顯差異（P＞0．05）。見圖1，表1。

2．2 各組大鼠垂體組織中HGPRT基因表達水平

與對照組比較，核苷酸組HGPRT mRNA增多（P＜0．05），海洛因組未見到顯著改變（P＞0．05）。見圖1，表1。

圖1 各組大鼠垂體組織中ADA和HGPRT基因表達水平

表1 各組大鼠垂體組織中ADA和HGPRT基因表達水平（n＝3，x—±s，λB／U·L－1）

3 討論

嘌呤核苷酸（AMP和GMP）作為RNA／DNA的組成成分，是細胞內非常重要的分子，同時在細胞間嘌呤核苷與核苷酸又是遞質，通過嘌呤能受體引起細胞內信號傳遞，參與幾乎所有的生命活動。腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）是降解嘌呤核苷酸的關鍵酶之一，催化腺嘌呤核苷轉化為次黃嘌呤核苷，進而分解成次黃嘌呤。次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（hypoxanthine－guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT）是嘌呤核苷酸補救合成關鍵酶，由于在腦組織內嘌呤核苷酸僅有補救合成途徑，因而HGPRT的作用很重要。

實驗結果顯示，與對照組比較，海洛因組、海洛因戒斷3d組大鼠垂體ADA mRNA相對表達量數值上有所增高，海洛因戒斷9d組又下降，但各組均未見明顯差異（P＞0．05）。這種變化的趨勢與以往文獻中睪丸、附睪組織相似［8］，但不同在于幅度較小。同時，與對照組比較，核苷酸組、核苷酸3d組、及核苷酸9d組ADA mRNA相對表達量的數值相近，也無統計學差異（P＞0．05）。可以觀察到海洛因成癮和戒斷時，同時給予嘌呤核苷酸能夠使ADA mRNA水平保持相對的穩定。

同時，與對照組比較，除核苷酸組HGPRT mRNA增多（P＜0．05），其他各組未見到顯著改變（P＞0．05）。雖然相對于對照組，海洛因組 HGPRT mRNA水平較低，但海洛因戒斷3d組數值上升，說明可能對于不同的酶，海洛因作用的起效時間有所差異。且在海洛因戒斷的同時給予嘌呤核苷酸（即核苷酸3d組），HGPRT mRNA水平更加接近于對照組。這提示補償核苷酸組依然表現出“對抗”海洛因的作用。

以往的研究表明，海洛因給藥加強了多種組織內嘌呤核苷酸的分解，并且降低了補救合成［3］，繼而導致了嘌呤核苷酸的代謝失衡。由于腦組織的特殊性，其內部僅有嘌呤核苷酸的補救合成，而缺乏從頭合成，使得腦組織內嘌呤核苷酸缺失。研究認為補償嘌呤核苷酸恰恰可以抑制這種缺失情況，從而抵抗了海洛因依賴導致的各種毒副作用［4］。同時海洛因依賴會使包括垂體的多種組織內細胞的超微結構造成損害［8］，而補償嘌呤核苷酸后可以緩解或抑制這種損害。海洛因成癮及戒斷的情況很復雜，同時補償嘌呤核苷酸是否可能從多個途徑進行調節和作用，垂體內嘌呤核苷酸的代謝情況及具體作用機制還有待于深入的研究。

［1］Goletiani NV，Mendelson JH，Sholar MB，et al．Opioid and cocaine combined effect on cocaine－induced changes in HPA and HPG axes hormones in men［J］．Pharmacol Biochem Behav，2009，91（4）：526．

［2］Graziani M，Antonilli L，Togna AR，et al．Non－opioid induction of morphine－6－glucuronide synthesis is elicited by prolonged exposure of rat hepatocytes to heroin［J］．Drug Alcohol Depend，2008，98（3）：179．

［3］Yang YD，Zhang JZ，Sun C，et al．Heroin affects purine nucleotides catabolism in rats in vivo［J］．Life Sci，2006，78（13）：1413．

［4］闞慕潔．嘌呤核苷酸補償對阿片類藥物與毒物作用的干預性研究［D］．長春：吉林大學，2008．

［5］何海濤，孫 婷，崔佳樂，等．嘌呤核苷酸補償對嗎啡依賴大鼠嘌呤核苷酸分解代謝的影響［J］．中國藥理學通報，2008，24（8）：1081．

［6］崔佳樂，劉昕鳴，王 巍，等．嘌呤核苷酸對海洛因依賴及戒斷大鼠心肌酶學的影響［J］．吉林大學學報（醫學版），2009，35（3）：474．

［7］Stojilkovic SS．Purinergic regulation of hypothalamopituitary functions．Trends Endocrinol Metab［J］．2009，20（9）：460．

［8］崔佳樂．海洛因及補償嘌呤核苷酸對雄性大鼠生殖內分泌系統的影響［D］．長春：吉林大學，2008．