人臍帶血內皮祖細胞體外培養、增殖和遷移

王田蔚，方 樂，馬晶波

（1．吉林大學中日聯誼醫院1．放射線科；2．神經內科，吉林 長春130033）

對血管內支架進行內皮化，有可能防止支架內再狹窄的發生，具有廣闊的臨床應用前景。文章采用新鮮臍血中分離的單個核細胞，在包含堿性成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子的環境中培養及擴增，經過形態學對比，結合免疫熒光法和流式細胞儀鑒定貼壁細胞；并與同期采集的臍靜脈內皮細胞在增殖和遷移能力兩方面進行對比。

1 材料和方法

1．1 材料

研究方案由院屬醫學倫理委員會審核并批準，新鮮臍血標本來自我醫院婦產科提供的足月妊娠健康產婦，事前均由產婦及家屬授權。

1．2 試劑與檢測儀器

人淋巴細胞分離液（LSM，美國 Mp bio公司）；M199培養液（杭州吉諾生物醫藥技術有限公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）；血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，美國Pepro Tech公司）；Dil標記乙酰化低密度脂蛋白（Dil－acLDL，Molecular probes公司）；人纖維連接蛋白、FITC 標記荊豆凝集素I（FITC－UEA－I，Sigma－aldrich 公 司 ）；FITC－CD34、PE－CD133（美 國eBioscience公司）；PerCP／Cy5．5－VEGFR－2（美國BioLegend公司）；CCK－8（日本同仁化學研究所）；Transwell小室（美國Costar公司）；倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細胞分析儀（美國BD公司）；酶標儀（美國THERMO公司）。

1．3 實驗方法

單個核細胞的分離：無菌離心管（預抗凝）采集臍血50ml；按1∶2的比例將PBS等倍稀釋后的臍血沿離心管壁緩慢置于淋巴細胞分離液上，離心25 min（500g／min），離心后將交界處混濁灰白色的單個核細胞層小心吸出，在以M199培養液離心洗滌2次（300g／min）。

向EPCs的誘導分化：首先用誘導分化培養液重懸的單個核細胞（培養液包括含20%胎牛血清的M199培養液，VEGF10μg／L，bFGF10μg／L，青霉素100U／ml，鏈霉素100U／ml），再將其接種到24孔培養板（5mg／L人纖維連接蛋白包被），置孵育箱培養（37℃、5%CO2），3天后首次換液，每3天更換1次，當細胞融合達到80%后胰酶消化細胞進行傳代培養，最終對比觀察細胞的形態學變化，同時進行生物學檢測。

人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）分離與培養：新生兒臍帶，0．25%胰蛋白酶（37℃預熱）灌注臍靜脈腔，37℃孵箱消化20min，終止消化，重懸細胞，并接種以及傳代（條件同向EPCs的誘導分化）。

EPCs吞噬DiI－ac－LDL以及結合FITC－UEA－I的功能鑒定：培養至第7天時取爬片的貼壁細胞，按比例（3mg／L）加入 Dil－ac－LDL，孵育箱孵育4h（5%CO2、37℃），20g／L多聚甲醛固定，再次洗滌后加入FITC－UEA－I（10mg／L），37℃孵育1h，最終經DAPI對比染色后激光共聚焦顯微鏡進行鑒定。

EPCs表型鑒定：分別于培養至第7和28天時用流式細胞儀檢測貼壁細胞，經胰酶消化后重懸細胞（細胞濃度為109L－1），加入 PE－CD133、FITCCD34和 PerCP／Cy5．5－VEGFR－2抗體，混勻后孵育30min（4℃并避光）。PBS洗去未結合的抗體，重懸后流式細胞儀檢測（以未加抗體的細胞為陰性對照）。

增殖能力對比：分別接種EPCs和HUVECs于96孔板（兩種細胞密度相同），每組均隔日取3孔利用CCK－8試劑盒檢測細胞增殖數量，連續監測7個時間點（1－14天）并最終繪制細胞生長曲線。

細胞遷移能力對比：對比利用24孔transwell小室（8μm孔徑）進行，上室加200μL的 M199培養液（含EPCs或HUVECs）；下室加誘導分化培養液孵育24h（37℃），擦去附著細胞，經染色后顯微鏡下計數，最終經醋酸脫色后將洗脫液用酶標儀測570nm吸光度值；本項實驗重復3次。

本實驗主要觀察指標：①人臍血EPCs形態觀察。②人臍血EPCs鑒定。③人臍血EPCs與HUVECs在體外增殖和遷移能力。

1．4 統計學分析 統計學分析采用SPSS17．0，數據以ˉx±s表示，兩組間比較應用t檢驗進行，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 單個核細胞細胞形態學變化

經分離洗滌后的單個核細胞呈懸浮的小圓形；至培養第3天時細胞明顯貼壁并出現細胞集落；至第7天左右特征性克隆形成，細胞群的中央部分為圓形細胞，周圍部分由梭形細胞放射狀分布；至第14天左右，貼壁細胞多呈梭形，并出現線樣排列，體積逐漸變大的同時邊界逐漸清楚；至第28天，基本細胞長滿底部，此時細胞呈“鋪路石樣”排列。

貼壁細胞熒光染色

攝取Dil－ac－LDL后細胞在激光共聚焦顯微鏡下表現為紅色，經過FITC－UEA－I染色的細胞鏡下表現為綠色，經DAPI復染后鏡下細胞核為藍色，上述三種染色均表現為陽性的正分化的EPCs，本實驗陽性率大于90%。

流式細胞儀分析

經過7天培養后細胞的CD133、CD34和VEGFR－2表達分別占29．3±4．8%，51．7±7．5%和68．2±8．1%。培養28天的細胞CD34和VEGFR－2的表達分別占7．9±3．8%和78．2±6．5%，此時未見CD133表達。

2．2 細胞增殖對比

經過CCK－8試劑盒檢測到的細胞增殖數量對比見增殖曲線（圖1），其中EPCs從培養第7天開始增殖速度明顯高于HUVECs，擴增后細胞數量可達109L－1。

圖1 內皮祖細胞和人臍靜脈內皮細胞的生長曲線

細胞遷移能力比較

EPCs遷移的細胞數明顯多于HUVECs，表明EPCs遷移能力占優（P＜0．05）。兩者吸光度值分別為0．283±0．03和0．269±0．02。

3 討論

Asahara等［1］1997年首次從人類外周血中分離出EPCs，后續研究發現EPCs是一類能增殖并分化為血管內皮細胞，有可能預防血管支架內再狹窄，因此具有非常重要的臨床意義。EPCs的常見來源為骨髓、臍血和外周血。其中骨髓來源創傷和風險較大；外周血來源的含量極低，僅占單個核細胞總數的0．002%；臍血來源中的EPCs含量約為外周血的10倍［2］，且來源廣泛，采集簡便，對供者無不良影響，不涉及倫理學問題，較為理想。

復習以往文獻，常用的EPCs分離方法是免疫磁珠分選法和密度梯度離心法。免疫磁珠分選法獲得的EPCs純度較高，但數量非常少，單獨培養難以大量增殖，且操作較復雜，價格昂貴，其實驗環境容易被污染，對培養中細胞的活性影響較大。相反，雖然密度梯度離心法獲得的細胞純度不高，但通過培養中貼壁篩選法仍可獲得較高的純度的EPCs，且經濟性好，可重復性較強。本實驗采用密度梯度離心法為基礎，獲得的實驗結果令人滿意。

EPCs的鑒定方法差異很大，根本原因在于EPCs缺乏特異性的表面標記。復習以往文獻，多數研究中的鑒定是通過細胞攝取Dil－ac－LDL，經過FITC－UEA－I染色包括DAPI復染和（或）應用流式細胞儀分析CD34＋、CD133＋、VEGFR－2＋表達兩種手段進行。一部分學者［3］認為正分化的EPCs能夠同時吸收 Dil－ac－LDL和結合 FITC－UEA－I；另一部分注重細胞功能的學者［2］認為能表達CD34、VEGFR－2和CD133的細胞是功能性內皮細胞的前體細胞，并通過對心臟醫用植入假體上被覆的新生內膜進行研究加以證實。本實驗結合兩種方案設計，綜合不同分離、培養和鑒定方法的優缺點，既觀察吸收 Dil－ac－LDL和結合 FITC－UEA－I的能力來判斷細胞類型及細胞功能，又應用流式細胞儀進行表型鑒定時結果顯示：經誘導分化后，細胞表面的CD133表達迅速下降最終于培養28天時消失；與之對應CD34和VEGFR－2等成熟內皮細胞的表面標志始終有表達，形態學觀察顯示最終分化為成熟內皮細胞應有的“鵝卵石樣”典型形態。本實驗結果表明EPCs經誘導可定向分化為成熟的內皮細胞，這與已有文獻報道相一致［4－7］，表明前述方法可以獲取較高純度和同源性的EPCs。

EPCs具有遲發高增殖潛能，這是功能上區別于成熟內皮細胞的主要特性。在體外環境下成熟內皮細胞4－6周后增殖能力明顯下降；而EPCs在培養15－20天后形成的內皮細胞，形態學呈迅速生長的典型“鵝卵石”樣排列，此形態學特征能穩定傳30代以上。既往研究表明EPCs在適宜的條件下可以快速增殖、分化，增殖的能力可以達到內皮細胞的10倍以上［8］，短時間培養即可達到覆蓋血管支架表面所需的數量。通過對EPCs和HUVECs的增殖和遷移能力進行對比分析，本實驗結果也提示EPCs可以快速增殖、分化，增殖能力明顯優于HUVECs，且遷移能力也明顯優于后者，這為EPCs應用于血管支架材料提供了理論依據。

綜上所述，結合密度梯度離心法和貼壁篩選法分離、純化臍血來源EPCs，經適當環境誘導分化，可向成熟內皮細胞轉化，形成的內皮細胞具有迅速生長的形態學特征且能穩定傳代，在體外環境中可大量擴增。EPCs可能成為預防血管支架內再狹窄的理想被捕獲細胞來源。

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