Cx36在癲持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元的表達

戴珍祥 高志偉

1）南京市六合區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南京 211500 2）南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南通 226000

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物與分組：健康雄性SD大鼠由南通大學(xué)實驗動物中心提供，共36只，6～8周齡，體質(zhì)量（250±20）g，隨機分為生理鹽水組、喹啉組、辛醇組，每組12只大鼠。

1.1.2 試劑與儀器：氯化鋰、匹羅卡品、喹啉、辛醇（美國Sigma公司）；兔抗大鼠Cx36多克隆抗體、熒光標(biāo)記Cx36抗體（北京博奧生生物技術(shù)公司）；二抗（碧云天生物技術(shù)公司）；冰凍切片機，正置顯微鏡（德國Leica公司）；電泳儀（美國Bio－Rad公司）。

1.2方法

1.2.1 動物模型制備與處理：氯化鋰－匹羅卡品誘導(dǎo)的癲大鼠模型是參照Glien［4］提出的方法，稍作改良后建立的。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，觀察大鼠飲食活動正常后稱重，將大鼠腹腔注射氯化鋰125mg／kg預(yù)處理，間隔18～24h后給予匹羅卡品60mg／kg腹腔注射，30min后觀察大鼠癲發(fā)作程度，達到Racine評分4級及以上的大鼠進入癲持續(xù)狀態(tài)（SE）。模型制備成功30min后分別予以各組大鼠腹腔注射喹啉（60mg／kg）、辛醇（60mg／kg）及等量生理鹽水。

1.2.2 Racine評分：根據(jù) Racine［5］制定的標(biāo)準(zhǔn)判斷是否有癲發(fā)作行為：0級（0分），無任何癲發(fā)作；1級（1分），嘴及面部陣攣，咀嚼，哈欠；2級（2分），1級基礎(chǔ)上出現(xiàn)點頭，面部抽搐，頸部肌肉抽動；3級（3分），2級基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢或后肢抽搐；4級（4分），3級基礎(chǔ)上出現(xiàn)后肢站立，身體突然立起；5級（5分），4級基礎(chǔ)上出現(xiàn)四肢節(jié)律性抽動，下肢強直伴全身背曲或抽動，跌倒。分別對各組癲持續(xù)狀態(tài)大鼠模型及給藥后30min、1h、2h及3h時進行Racine評分。

1.2.3 Cx36表達檢測：各組大鼠分別于給藥后2h進行海馬Cx36表達檢測。（1）免疫熒光方法：用3.5%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉，開胸暴露心臟，左心室插管，剪開右心耳，先快速灌入溫生理鹽水100mL至血液沖凈，隨后灌入4%多聚甲醛500mL固定。灌注固定后開顱取腦，4%甲醛浸泡，蔗糖梯度脫水，冰凍切片機切片，山羊血清封閉過夜，0.1%PBS洗滌后予以4℃條件下孵育熒光標(biāo)記抗體過夜，再次洗滌后貼腦片、甘油封片，然后在熒光顯微鏡下觀察海馬Cx36的變化。（2）Western－blot方法：將大鼠急性斷頭，在冰上取出腦組織，秤取100mg海馬組織在1000μL蛋白裂解液加10μL蛋白酶抑制劑中勻漿，充分混勻后高速離心沉淀，取上清液，通過BCA法測出蛋白濃度。按每上樣孔60 μg蛋白上樣量計算出上樣容積，上樣至已制備好的10%分離膠板上樣孔里，以恒壓110V1.5h及恒流350mA 2h分別進行電泳及轉(zhuǎn)膜，然后牛奶封閉2h、一抗4℃孵育過夜、二抗室溫2h孵育、Ecl發(fā)光、暗房顯影定影，應(yīng)用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)拍照，計算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值，表示相對含量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，用藥前后行為學(xué)評分差異應(yīng)用配對t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，組間兩兩比較用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠Racine評分比較見表1，生理鹽水組大鼠給藥前后Racine評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。喹啉組及辛醇組大鼠給藥前后Racine評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與生理鹽水組比較，給藥后喹啉組及辛醇組Racine評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

表1 各組大鼠Racine評分比較 （s，分）

表1 各組大鼠Racine評分比較 （s，分）

注：與給藥前比較，＊P＜0.01；與生理鹽水組比較，△P＜0.01

組別 n 給藥前30min 給藥后30min 給藥后1h 給藥后2h 給藥后3h生理鹽水組 12 4.21±0.18 4.63±0.18 4.75±0.16 4.50±0.19 4.25±0.16喹啉組 12 4.32±0.25 1.13±0.14﹡△ 2.00±0.27﹡△ 0.88±0.12﹡△ 0.75±0.15﹡△辛醇組 12 4.29±0.27 1.25±0.23﹡△ 2.13±0.35﹡△ 1.00±0.15﹡△ 0.88±0.23﹡△

2.2各組大鼠海馬組織Cx36表達比較見表2。

2.2.1 應(yīng)用免疫熒光法檢測大鼠海馬Cx36陽性細(xì)胞的表達：通過免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)各組均有Cx36陽性細(xì)胞的表達，生理鹽水組Cx36陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于喹啉組及辛醇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而后2組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、圖2、圖3。

圖1 生理鹽水組海馬神經(jīng)元C×36表達 A 10×10、B 10×20、C 10×40

圖2 喹啉組海馬神經(jīng)元C×36表達 D 10×10、E 10×20、F 10×40

圖3 辛醇組海馬神經(jīng)元C×36表達 G10×10、H10×20、I10×40

2.2.2 應(yīng)用 Western－blot方法檢測大鼠海馬Cx36含量的變化：見圖4。通過 Western－blot方法檢測發(fā)現(xiàn)各組均有Cx36蛋白，生理鹽水組明顯高于喹啉組及辛醇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而后2組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠海馬神經(jīng)元C×36表達變化 a：生理鹽水組，b：喹啉組，c：辛醇組

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元Cx36表達比較（s）

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元Cx36表達比較（s）

注：與生理鹽水組比較，＊P＜0.01

組別 n 陽性細(xì)胞數(shù)（個／mm2）灰度比生理鹽水組12 82.53±0.32 0.56±0.003喹啉組 12 27.34±0.18﹡ 0.21±0.004﹡辛醇組 12 26.24±0.29﹡ 0.24±0.005﹡

與生理鹽水組比較，喹啉組及辛醇組大鼠海馬Cx36表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而后2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

［2］Fukuda T.Gap junctions among dendrites of cortical GABAergic neurons establish a dense and widespread intercolumnar network［J］.Neurosci，2006，26（13）：3 434－3 443.

［3］Rash JE.Identification of cells expressing Cx43，Cx30，Cx26，Cx32and Cx36in gap junctions of rat brain and spinal cord［J］.Cell Commun Adhes，2001，8（4）：315－320.

［4］Glien M.Repeated low－dose treatment of rats with pilocarpine：low mortality but high proportion of rats developing epilepsy［J］.Epilepsy Res，2001，46（2）：111－119.

［5］Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.Ⅱ.Motor seizure［J］.Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32（3）：281－294.

［6］Condorelli DF.Cloning of a new gap junction gene （Cx36）highly expressed in mammalian brain neurons［J］.Eur J Neurosci，1998，10（3）：1 202－1 208.

［7］Condorelli DF.Expression of Cx36in mammalian neurons［J］.Brain Res Brain Res Rev，2000，32（1）：72－85.

［8］Medina－Ceja L，Ventura－Mejía C.Differential effects of trimethylamine and quinine on seizures induced by 4－aminopyridine administration in the entorhinal cortex of vigilant rats［J］.Seizure，2010，19（8）：507－513.

［9］Gajda Z.Involvement of gap junctions in the manifestation and control of the duration of seizures in rats in vivo［J］.Epilepsia，2003，44（12）：1 596－1 600.

［10］Beheshti S.Changes in hippocampal connexin 36mRNA and protein levels during epileptogenesis in the kindling model of epilepsy［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2010，34（3）：510－515.

［11］Jacobson GM.Connexin36knockout mice display increased sensitivity to pentylenetetrazol－induced seizure－like behaviors［J］.Brain Res，2010，1360：198－204.