某縣204例乙型肝炎病毒基因型及其臨床相關性分析

某縣204例乙型肝炎病毒基因型及其臨床相關性分析

目的了解重慶墊江縣地區乙型肝炎病毒（HBV）基因型的分布及其與臨床的相關性。方法選取墊江縣HBVDNA陽性的HBV感染者204例，應用聚合酶鏈反應（PCR）和直接測序法檢測HBV基因型并分析其與臨床的相關性。結果204例 HBV－DNA陽性血清標本中，測序成功為146例。其中B型98例（67.12%），C型47例（32.19%），D型1例（0.69%），C基因型丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）指標高于B基因型（P＜0.05）；C基因型患肝硬化和肝細胞癌的比例高于B基因型（P＜0.05）。結論B型為本地區的優勢基因型，并且C型HBV感染者易引起肝臟的嚴重損傷。

肝炎病毒，乙型；基因型；臨床相關性

HBV感染呈全球性分布，各地區不同程度的流行性與生活習慣、經濟條件、人種等因素有關外，與病毒本身的生物學特點更加密切相關［1］。從1988年開始，根據HBV全基因序列異質性大于等于8%的界限，對HBV核苷酸進行序列分析，HBV被分為8個基因型：即 A、B、C、D、E、F、G和 H［2］。HBV基因型呈地域分布，不同基因型在致病性、對藥物的敏感性及基因變異等方面均有差異［3］。現將墊江縣204例乙型肝炎病毒基因型及其臨床相關性分析報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取重慶市墊江縣人民醫院門診及住院的HBV－DNA陽性的HBV感染者204例，其中，慢性乙型肝炎183例，肝硬化15例，肝細胞癌6例；疾病的診斷依據參照2000年全國肝炎會議擬訂方案。所有標本經乙型肝炎5項檢測，其中115例表面抗原、e抗原、核心抗體為陽性，85例表面抗原、e抗體、核心抗體為陽性，3例表面抗原、e抗原為陽性，僅1例表面抗原陽性。標本（血清）保存于－80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 微量樣品基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、2×Pfu PCR Master Mix、1 000bp DNALadder購自德國Qiagen公司；HBV血清學標志物檢測試劑盒、HBVDNA熒光定量PCR試劑盒購自廣州達安有限公司，瓊脂糖購自美國Gibco公司，引物由TaKaRa有限公司合成。PCR擴增儀為北京生物有限公司產品，HC－3018R型高速冷凍離心機為科大創新公司產品，凝膠圖像分析系統DocGel2000為美國BioRad公司產品，熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。

1.2.2 HBV S基因擴增和測序 按照Qiagen微量樣品基因組DNA提取試劑盒說明書處理標本，獲得模板DNA。PCR擴增 HBV S基因：正義鏈：5′－GCG GGG TTT TTC TTG TT GA－3′反義鏈：5′－GGG ACT CAA GAT GTT GTA CAG－3′，引物由TaKaRa有限公司合成。PCR反應體系（總量25μL）：2×Taq PCR Master Mix 13μL；模板DNA 3μL；正義鏈引物（10μmol／L）1μL；反義鏈引物（10μmol／L）1μL；雙蒸水7μL。PCR反應條件：95℃10min；95℃30s；52℃45s；72℃90 s；72℃10min；35個循環。將204份PCR擴增產物（25μL）送北京華大基因公司測序。將測得基因序列與Gen Bank進行同源性比較，以確定HBV基因型。

1.2.3 HBV－DNA、肝 功 能 及 乙 型 肝 炎 標 志 檢 測 運 用ABI7300熒光定量PCR儀檢測HBV－DNA；采用AU2700全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）；應用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測 HBsAg、抗－HBs、HbeAg、抗－Hbe、抗－HBc等乙型肝炎標志物，按產品說明書操作。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，計數資料采用χ2檢驗和t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

測序成功146例，其中，慢性乙型肝炎125例，肝硬化15例，肝細胞癌6例；B型98例（67.12%），C型47例（32.19%），D型1例（0.69%）；B型男66例，女32例，年齡（33±16.5）歲；C型男32例，女15例，年齡（35±13.6）歲；D型男0例，女1例，年齡22歲。HBV基因型與患者血清學標志物及HBVDNA載量的關系、患者臨床表現及預后的關系及不同HBV基因型與病情比較見表1～3。

表1 B、C基因型HBV－DNA水平及HBeAg陽性率比較

表2 B、C型ALT、AST比較

3 討 論

HBV基因型是長期點突變累積形成的，由于HBV在逆轉錄過程中的不對稱轉錄和缺乏校對酶的作用，HBV突變率較高。最近有報道在越南發現新的 HBV基因型I［4］，使得HBV基因型增至9個。隨著進一步深入研究，發現同一種基因型，病毒的序列特點及臨床表現也存在一定的差異，根據全基因組序列異質性大于4%而小于8%的原則，HBV基因型進一步可分為不同的基因亞型，如：A基因型可分為A1（Aa）、A2（Ae）、A3（Ac）亞型；B基因型可分為 B1（Bj）、B2（Ba）、B3、B4亞型；C基因型可分為C1、C2、C3、C4亞型等。近年的研究表明，HBV分型在HBV基因型之間存在一定的流行病學與臨床特征差異［5］。Zeng等［6］研究表明，中國 HBV感染者的基因型主要是B和C型，南方地區主要以B型為主，北方地區則以C型較多。本文應用HBV S區基因直接測序法來進行分型，該方法準確度高，結果可靠；檢測出墊江縣HBV感染者的基因型以B型居多，與文獻報道結果一致；但本調查結果也顯示，HBV基因型與性別及年齡之間沒有相關性。

HBV感染人體后，由于感染者的HBV基因型、年齡、機體免疫力、及HBV－DNA載量等的不同，他們的臨床表現及預后也有差異。可表現為：一過性病毒血癥、急性肝炎、無癥狀的病毒攜帶狀態、慢性肝炎、肝衰竭、肝硬化及肝癌。本研究顯示，C型感染者血清ALT、AST水平均高于B型，且基因C型感染者較B型感染者更易發生肝硬化以及肝細胞癌；這與鐘崇芳等［7］報道，基因C型感染者其肝臟炎癥壞死評分高于基因B型感染者，和基因C型HBV感染者較B型感染者更易發展為肝硬化和肝癌［8］的報道一致。提示HBV基因型與疾病的活動性可能存在一定關系。

本調查對墊江縣HBV感染者不同基因型的臨床特征分析提示，基因B型和基因C型感染者HBeAg陽性率和HBVDNA水平的差異無統計學意義。對于不同基因型HBV－DNA水平及HBeAg陽性率之間關系的報道眾說紛紜［9－10］。有研究報道，基因C型較B型的HBV－DNA水平更高；也有報道稱，在HBeAg陽性患者中HBV－DNA病毒載量較高的是：基因C型，而HBeAg的陰性患者中基因D型者病毒載量更高［11］。也有報道稱，不同基因型間的HBeAg陽性率及HBV－DNA沒有關系。因此，不同HBV基因型間 HBeAg陽性率和 HBVDNA含量的關系有待進一步研究。

還有研究表明，HBV基因型與抗病毒治療有關［12］，但由于目前缺乏大量HBV基因型分型與治療關系的前瞻性研究，國際上還沒將HBV基因型分型作為用藥指標和治療標準，然而對基因型的研究卻仍然勢在必行，希望通過大家的共同努力能使其成為乙型肝炎病毒個性化治療的一個重要指標。

通過本研究了解到墊江縣HBV基因型的分布情況及其與臨床表現及預后的關系，有利于指導臨床醫生選擇合理的治療方案及個體性指導用藥，為有效控制本縣乙型肝炎病情提供了實驗依據。

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Analysis on 204 cases of hepatitis B virus genotypes in a county and their clinical correlation

MaMingyan1，Liao Liya1，Yu Dengqiong1，Xiong Zhongzheng1，GuoYuanyuan2，Liao Pu2△
（1.Department of Clinical Laboratory，Dianjiang County People′s Hospital，Chongqing408300，China；2.Chongqing Municipal Clinical Laboratory Center，Chongqing400014，China）

ObjectiveTo investigate the distribution of hepatitis B virus（HBV）genotypes in Dianjiang area of Chongqing and their clinical correlation.MethodsSerum samples from 204HBV－DNA positive patients with chronic HBV infection，including 183cases of chronic hepatitis B（CHB），15cases of liver cirrhosis（LC）and 6cases of hepatocellular carcinoma（HCC），were collected and detected for HBV genotypes by PCR and direct sequencing.Their clinical correlation was analyzed.ResultsOf all 204 HBV－DNA positive serum samples，146cases were detected successfully by direct sequencing，including 98cases（67.12%）of genotype B，47cases（32.19% ）of genotype C and only 1cases（0.69%）of genotype D.The value of ALT and AST in genotype C was significantly higher than that in genotype B（P＜0.05）；genotype C was more prevalent in LC and HCC than genotype B（P＜0.05）.ConclusionGenotype B is the superior genotype in this area.Genotype C may induce more serious damage of liver in the patients with chronic HBV infection.

hepatitis B virus；genotype；clinical correlation

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.024

A

1671－8348（2012）35－3747－02

△

，Tel：（023）63519127；E－mail：liaopu＠sina.com。

2012－08－13

2012－10－23）

△通訊作者，Tel：13983186966；E－mail：469498331＠qq.com。

·調查報告·