膽紅素對L－02細胞凋亡以及Bcl－2及Bax體外表達影響的研究

陳兆夷，陳兆武，王光明，鄧衍部，劉有理，黃志剛

（1.安徽省宣城市人民醫院消化內科 242000；2.安徽醫科大學基因重點實驗室，合肥230022）

膽紅素對L－02細胞凋亡以及Bcl－2及Bax體外表達影響的研究

陳兆夷1，陳兆武2，王光明1，鄧衍部1，劉有理1，黃志剛1

（1.安徽省宣城市人民醫院消化內科 242000；2.安徽醫科大學基因重點實驗室，合肥230022）

目的探討膽紅素對健康人肝細胞系L－02凋亡的影響及Bcl－2、Bax基因對凋亡過程的調節。方法將不同濃度的膽紅素（終濃度分別為0、100、150、200、250、300mg／L）作用于體外培養的健康人肝細胞L－02，采用流式細胞儀和碘化丙啶（PI）雙標等技術觀察細胞的凋亡率和免疫組織化學方法檢測細胞凋亡狀態及凋亡相關基因Bcl－2、Bax蛋白的表達。結果Bcl－2蛋白的表達，對照組為陰性表達，低濃度組弱陽性表達，高濃度組強陽性表達。Bax蛋白的表達，對照組可見表達，低濃度組表達增多，高濃度組明顯增多，強陽性表達。表明Bcl－2蛋白表達越強，凋亡指數越少；Bax蛋白表達越強，凋亡指數越強。結論Bcl－2、Bax蛋白均參與了膽紅素所誘導的L－02細胞凋亡的調節，并在細胞凋亡的發生、發展中起重要作用。

膽紅素；細胞凋亡；L－02細胞系；Bcl－2；Bax

筆者在前期研究中證明，高膽紅素作用可導致L－02細胞先發生凋亡，隨后部分凋亡細胞發生繼發性壞死，其程度與膽紅素濃度呈顯著正相關［1］。關于膽紅素對L－02細胞凋亡的機制及Bcl－2與Bax表達在其過程中的意義，筆者進行了后續研究，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 膽紅素、DMEM培養基為美國Gibco公司產品；小牛血清為杭州四季青生物制品有限公司產品。

1.2 主要儀器 采用倒置熒光顯微鏡（德國LEICA公司），FACSCalibur型流式細胞檢測儀（美國BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 膽紅素標準液的配制［2］精確稱取膽紅素20mg，溶于稀釋血清80mL（其中血清和生理鹽水的比例是1∶24），加4mL二甲亞砜（DMSO）和2mL碳酸鈉（Na2CO3）（0.1mol）制成濃度為200mg／L（342μmol／L）的膽紅素溶液。每次實驗前膽紅素溶液均新鮮配制，所有實驗步驟均在弱光下進行，以防止膽紅素轉變為其同分異構體。

1.3.2 細胞培養 健康人肝細胞系L－02細胞購于南方醫科大學，L－02細胞接種于體積分數15%胎牛血清、青鏈霉素各100U／mL和谷氨酰胺2mol／L的DMEM培養液中，置37℃、5%CO2、95%濕度條件下的培養箱中培養，平均每2～3天換液、傳代1次，實驗時使用指數生長期細胞。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 應用不同濃度膽紅素溶液作用12h后收集各組細胞（1×106／mL），0.25%胰酶37℃消化細胞，至縮呈圓形，收集細胞入離心管離心（1 000r／min，10min），棄上清液，冰冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，200μL結合緩沖液輕輕重懸細胞。加入10μL Annexin－V異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），4 ℃避光孵育 30 min。加入300μL結合緩沖液和5μL濃度為20μg／mL的碘化丙啶（propidium iodide，PI）輕輕混勻，立即上機檢測。檢測在安徽省立醫院中心實驗室完成。

1.3.4 膽紅素對人肝細胞L－02Bcl－2、Bax蛋白表達的影響將L－02細胞（1×106／mL）接種于6孔板中進行細胞爬片，細胞貼壁后應用不同濃度膽紅素溶液作用24h（終濃度分別為0、100、150、200、250、300mg／L）；棄上清液后用PBS洗2次并用多聚賴氨酸固定玻片；每張片加1滴過氧化氫酶阻斷溶液（試劑A），室溫下孵育20min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗4min 3次。去除PBS，滴加動物血清（試劑B）封閉，室溫下孵育20min，清除非特異性吸附，以降低非特異性背景著色。擦去多余血清，滴加一抗Bcl－2（工作液），室溫下孵育3～4h，PBS沖洗4min 3次。滴加生物素化二抗工作液（試劑C），室溫下孵育20min，PBS沖洗4min 3次。去除PBS，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶（試劑D），室溫下孵育20 min，PBS沖洗4min 3次。去除PBS，滴加DAB顯色液染色3 min。水洗終止，蘇木素染色，自來水沖洗返藍。脫水干燥，透明，封片，光鏡下觀察，照相。判斷標準：按染色強度評分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，染色強度需與背景色相對比。

1.4 統計學處理 采用PEMS3.1for Windows統計軟件進行分析，經方差齊性檢驗，各組方差齊，采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；各組方差不齊，采用秩和檢驗；判斷兩數值變量間有無直線相關關系，及其相關方向和程度，采用相關分析法檢驗，結果用±s表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 膽紅素誘導L－02細胞凋亡率變化 經流式細胞儀檢測，凋亡的L－02細胞分布在左上區，而正常細胞為FITC和PI均低染，分布在流式細胞分析圖的左下區。早期凋亡細胞以Annexin V－FITC染色為主，在流式細胞分析圖的右下區，晚期凋亡細胞則Annexin V－FITC和PI雙染色，位于流式細胞分析圖的右上區。本研究結果表明，膽紅素能誘導L－02細胞凋亡，細胞凋亡率與膽紅素濃度呈濃度－效應關系（圖1）。相關分析表明，細胞壞死數量與膽紅素濃度之間無明顯相關（r＝0.515 6，P＝0.295 2），但細胞凋亡數量與膽紅素濃度之間呈顯著相關（r＝0.885 2，P＝0.019 0）。

圖1 流式細胞儀檢測不同濃度膽紅素作用L－02細胞12h后的凋亡的變化

2.2 免疫組織化學法檢測 Bcl－2、Bax蛋白的表達 Bcl－2在300mg／L組偶見棕黃色顆粒狀，呈散在、弱陽性表達，200mg／L組與300mg／L組相比較陽性細胞數增多，染色加深，呈黃褐色表達，見封3圖2～4。

Bax主要在肝細胞胞漿呈棕黃色顆粒狀；0mg／L組未見陽性表達，200mg／L組可見肝細胞散在、弱陽性表達，較150 mg／L組有所增強，陽性細胞數增多，250mg／L組陽性染色進一步加深，陽性細胞多，300mg／L組肝細胞彌漫陽性染色，染色加深，陽性細胞數增多，見封3圖5～7。

3 討 論

細胞凋亡是細胞有序而協調激活凋亡刺激基因和凋亡抑制基因共同控制的過程［3］。在線粒體調控細胞凋亡的體系中，Bcl－2、Bax是線粒體膜蛋白中最重要的代表。Bcl－2、Bax比例失調可能是肝細胞凋亡增加的原因之一［4］。Bcl－2基因是目前最受關注的與細胞凋亡相關的基因之一。Bcl－2基因蛋白表達產物定位于線粒體膜、核膜和內質網，任其氨基酸C－末端由19個氫基酸殘基組成的疏水性片段，并借此與膜相連。通過轉基因動物和基因轉染實驗研究發現，Bcl－2對細胞凋亡具有明顯的抑制作用［5］。目前，已發現多種與Bcl－2同源的基因，如Bclxl、Bcl－xs、Bax基因等［6］。這些基因構成了Bcl基因家族，在體內Bcl－2基因家族的成員可以具有兩種截然不同的功能，Bax基因是今年來新發現的一種凋亡促進基因，屬Bcl－2同一家族。Bcl－2保護線粒體的完整性，抑制細胞色素C的釋放，而Bax在線粒體膜上形成多聚體影響其完整性，使線粒體釋放Caspase活化因子（如細胞色素C等）并進入胞漿中，誘發Caspase家族表達引起的細胞凋亡［7］。Bax蛋白的氨基酸序列有21%與Bcl－2同源，有3種不同的編碼蛋白Bax－α、Bax－β及Bax－γ。Bax基因具有拮抗 Bcl－2抑制凋亡的作用。Bcl－2及Bax蛋白都是均一的二聚體，反應時需一個分子Bcl－2及一個分子Bax結合，形成異二聚體，結合后的蛋白才具有調節功能［8］。Bax／Bcl－2的比值，對于決定細胞接受刺激信號后存活與否起關鍵作用。Bcl－2過量表達（Bcl－2－Bcl－2），細胞存活；Bax過量表達（Bax－Bax）細胞死亡。

本研究證實，在高濃度膽紅素時Bcl－2不表達或少量表達，肝組織出現細胞凋亡明顯增加；在低濃度膽紅素時，Bcl－2大量表達，出現肝組織細胞凋亡明顯減少而表明，Bcl－2的表達起到了抑制肝細胞凋亡的作用。Bax明顯高表達時，體外膽紅素作用L－02細胞凋亡明顯增多，同時，Bcl－2蛋白表達越強，凋亡指數就越少；Bax蛋白越強，凋亡指數就越高。表明Bcl－2和Bax蛋白均參與了體外膽紅素作用于L－02細胞凋亡的調節，Bcl－2起抑制凋亡的作用，Bax起促進凋亡的作用，他們在高膽紅素時所致肝損害的發生、發展中起著重要作用。

本研究應用凋亡定性（DNA片段、Hoechst33258熒光染色）分析獲取凋亡的直接證據和定量（流式細胞儀）對細胞凋亡進行觀察；也分別從凋亡的早期（PI－Annexin V雙染色法）和晚期（DNA片段）檢測；免疫組化法進一步檢測膽紅素處理肝細胞24h后Bcl－2與Bax的表達水平的變化。綜合分析結果，為高膽紅素血癥可以誘導健康人肝細胞的凋亡，并呈良好的劑量－效應關系。這種現在也許就可以用高膽紅素血癥誘導肝細胞凋亡，部分的解釋“膽酶分離”現象高死亡率的原因。與以往對于肝臟衰竭的發生是肝細胞的急性大量死亡不能為細胞增生所補償的結果的認識有所改變。本研究結果提示，高膽紅素血癥的時候，凋亡是肝細胞的第一反應，而壞死則往往出現于細胞凋亡之后，肝細胞的凋亡過程對隨之出現的肝細胞壞死的行程起著至關重要的作用。也許可以試著從抑制細胞凋亡這個源頭來治療肝衰竭。在膽紅素到達一定水平時，給予積極的預防凋亡等治療以防止肝細胞進一步壞死。通過對Bcl－2、Bax基因的進一步深入研究，有望為探討膽紅素誘導L－02細胞凋亡的發生機制以及在高膽紅素血癥所指肝損害發生、發展中所其的作用提供理論依據。

［1］陳兆夷，陳兆武，李勝聯，等.體外膽紅素對L－02細胞生長與凋亡的影響［J］.第三軍醫大學學報，2010，24（32）：2656－2658.

［2］Berns M，Toennessen M，Koehne P，et al.Ibuprofen augments bilirubin toxicity in rat cortical neuronal culture［J］.Pediatr Res，2009，65（4）：392－396.

［3］Spfick MR，Walczak H.The interplay between the bcl－2 family and death receptor－mediated apoptosis［J］.Biochem Biophys Acta，2004，1644（2／3）：125－132.

［4］Di Nardo A，Benassi L，Magnoni C，et al.Ceramide 2（N－acetyl sphingosine）is associated with reduction in bcl－2 protein levels by Western blotting and with apoptosis in cultured human kerationocytes［J］.Dermatol，2000，143（3）：491－497.

［5］Heibein JA，Goping IS，Barry M，et al.Granzyme B－mediated cytochrome crelease is regu1ated by the bcl－2family members bid and Bax［J］.J Exp Med，2000，192（10）：1391－1402.

［6］冉立偉，譚升順，王萬卷，等.全反式維A酸、阿維A和他扎羅汀對人黑色素瘤細胞A375凋亡和Bax／Bcl－2蛋白表達的影響及意義［J］.第一軍醫大學學報，2005，25（8）：972－978.

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A research of the influence of bilirubin on the apoptosis of L－02 cell line and the expression of Bcl－2 and Bax

Chen Zhaoyi1，Chen Zhaowu2，Wang Guangming1，Deng Yanbu1，Liu Youli，Huang Zhigang1
（1.Department of Gastroenterology and Hepatlolgy，The People′s Hospital of Xuancheng City，Xuancheng，Anhui 242000，China；2，Department of Laboratory Medicine，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032，China）

ObjectiveTo investigate the influence of bilirubin on the apoptosis of L－02cell line in healthy human liver，and investigate the regulation of Bcl－2and Bax on the apoptosis process.MethodsThe L－02cells cultured in vitro and treated with bilirubin with the concentration 0，100，150，200，250，300mg／L respectively.The growth and apoptosis of L－02cell was assessed by flow cytometry Annexin V and PI；the expression of gene Bcl－2and Bax were detected by immunohistochemistry.ResultsImmunohistochemistry showed a negative expression of Bcl－2in the control group，a weak positive expression in the low concentration group and a strong positive expression in the high concentration group；and a visible expression of Bax in the control group，an increased expression in the low concentration group and a significantly increased strong positive expression in the high concentration group.This indicates that the expression of Bcl－2has a negative corelation with apoptotic rate nevertheless the Bax expression has a positive corelation.ConclusionBcl－2and Bax could regulate the apoptosis of L－02cell line induced by bilirubin and play an important role in the occurance and development of cell apoptosis.

bilirubin；apoptosis；L－02cells；Bcl－2；Bax

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.010

A

1671－8348（2012）35－3713－02

2012－06－13

2012－09－12）

·臨床研究·