柑橘潰瘍病土壤拮抗菌的篩選、鑒定及防效測定

董玉蘭，唐前君，易圖永，肖啟明

（湖南農業大學生物安全科技學院，湖南 長沙 410128）

柑橘潰瘍病是一種細菌性植物病害，因導致植株枝葉及果實產生潰瘍性病斑而得名，公認為世界性的檢疫病害，對農業生產造成巨大損失[1]。近年來，柑橘潰瘍病的防治已經由最初的化學防治轉向更具優勢的生物防治[2]。生物防治的優勢在于其防治劑只對有害病菌起作用，不僅可避免化學藥物對農產品的污染，而且可保護生態環境免遭破壞[3]。而拮抗微生物的利用又是生物防治措施中的研究重點。有報道稱可從柑橘葉片、果實及柑橘園土壤中分離出有拮抗作用的菌株[4-5]，因此筆者采集了湖南不同地區的土壤，擬從中分離純化出對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的微生物，再通過篩選及室內防效測試，選取防效最好的菌株，為制備柑橘潰瘍病生物防治劑做準備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通過5 點取樣法分別于慈利、郴州、永州、長沙等地的水稻、煙草、柑橘產區采集了16 個土壤樣品；供試病原菌和供試柑橘苗（臍橙）由國家柑橘改良中心長沙分中心提供；供試培養基有牛肉膏蛋白胨培養基、高氏一號培養基（放線菌）、PDA 培養基（真菌）。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌分離與純化 取各種土樣10 g，放入裝有90 mL 無菌水（有玻璃珠）的三角瓶中，震蕩1 h；將菌懸液依次稀釋；細菌采用混勻法，真菌和放線菌采用涂沫法進行分離純化[6-7]。從采集到的16個土樣中，共分離出細菌167 株，放線菌92 株，真菌88 株，總計347 株，用于拮抗試驗。

1.2.2 拮抗菌株篩選 采用平板對峙法進行初篩，選擇初篩試驗中有拮抗效果的菌株進行牛津杯法復篩[8-9]。

1.2.3 拮抗菌形態學觀察 采用基礎培養基表面劃線的方法，觀察菌落形態；用大腸桿菌和葡萄球菌分別作陰性和陽性對照，對拮抗效果最好的菌株做鏡檢，觀察其顯微結構。鑒定標準參照《常見細菌系統鑒定手冊》[10]進行。

1.2.4 拮抗菌室內防效試驗 選取復篩試驗中拮抗效果明顯的菌株進行活體防效試驗。供試拮抗菌和供試柑橘潰瘍病菌分別制備成濃度約為1×108cfu/mL 的菌懸液，采用雙面噴施的方法做4 組處理：A 先噴施拮抗菌菌懸液（AM），2 d 后噴施柑橘潰瘍病病原菌菌懸液（PC）；B 同時噴施AM 和PC；C 先噴施PC，2 d 后噴施AM；D 同時噴施PC 和清水做對照，每個處理3 次重復，每個重復20 個葉片，接種后，保濕10 d，控制環境溫度在28℃左右，每隔一個星期觀察一次發病情況。抗潰瘍病分級標準參照《農藥田間藥效試驗準則》[11]進行。

發病率、病情指數和相對防效的計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 拮抗菌篩選

平板對峙初篩后得到有拮抗作用的細菌21株，放線菌6 株，真菌4 株。牛津杯法復篩后得到3個拮抗效果最好的菌株CZR1、CLH2、CLT3，分別來自郴州仁義鎮水稻土、張家界慈利鄉柑橘園土和張家界慈利鄉柑橘園土。從圖1 可知：CZR1 號菌株的抑菌圈直徑的平均值在43 mm 左右，抑菌圈邊緣模糊；CLH2 菌株的抑菌圈直徑的平均值在55 mm左右，抑菌圈邊緣略微隆起；CLT3 的抑菌圈直徑的平均值在45 mm 左右，抑菌圈邊緣清晰。

圖1 3 株拮抗菌的抑菌效果

2.2 拮抗菌形態學

從圖2 可看出，CZR1 的菌落小而密集，圓滑不透明，不產色素；CLH2 的單菌落表面圓滑且體積大，直徑可達5 mm 左右，不透明，菌體產綠色素，培養基呈綠色；CLT3 的單菌落大小較為均勻，質地緊密不易挑起，干燥多皺的表面產生一層白色絨毛狀的菌絲，與放線菌的菌落形態相似，其培養基的顏色因菌體產黑色素而發黑。

圖2 3 株拮抗菌菌落形態

通過革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色及莢膜染色法對三株拮抗效果顯著的菌株光學顯微觀察，其特征如下：CLT3 ，革蘭氏染色陽性，無芽孢，無鞭毛，也無莢膜；CLH2，革蘭氏染色陰性，無芽孢，有單鞭毛和莢膜；CZR1，革蘭氏染色陰性，有芽孢和莢膜，無鞭毛。

顯微結構顯示：CLT3 呈分枝絲狀，氣生菌絲白色，基內菌絲深灰色，孢子卵圓形，具典型的放線菌特征；CLH2 為兩端鈍圓的桿狀，有的排成線狀，有的排成短鏈狀；CZR1 為棒狀，同CLH2 一樣表現出細菌的特征。

表1 3 株拮抗菌生理生化反應

2.3 拮抗菌生理生化反應

3 株拮抗菌的生理生化測定結果顯示（表1），3株菌株在氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發酵等多項生化測試中呈現明顯差異。在15 項檢測中，CLT3與CLH2 有8 項結果相同，與CZR1 有10 項結果相同，而CLH2 和CZR1 的測試結果有11 項相同，CLH2 和CZR1 的親緣關系較之CLT3 和CZR1、CLT3 和CLH2 較為親近。根據生理生化測定結果和《常見細菌系統鑒定手冊》初步判斷，CLT3 為鏈霉菌屬，CLH2 為假單胞菌屬，CZR1 為伯克氏菌屬。

2.4 拮抗菌溫室防效

不同處理方式的防效結果顯示（表2），B 處理的發病率與病情指數明顯低于A 和C 處理，防效較之A、C 更為明顯。綜合三株拮抗菌看，CLT3 的防效最為突出，尤其是B 處理防效達到83.85%。統計分析結果表明，試驗組的柑橘潰瘍病的發病率和病情指數均比對照組低，三株拮抗菌的防效基本都在50%以上。這說明在溫室環境下（28～30℃，濕度40%），以上三株拮抗菌皆表現出較好的防效。

表2 3 株拮抗菌溫室防治效果

3 結 論

試驗從水稻田區，煙草輪作區，荒廢的柑橘園區及無病的園區采集了16 種土壤樣品，分離純化出31 株拮抗菌株，占總菌數的8.93%。其中，來自無病柑橘園區的菌株占所有拮抗菌總數的74.19%，可見無病的柑橘園區是分離柑橘潰瘍病菌的主要來源。杯碟法試驗結果顯示，31 株拮抗菌株中CZR1、CLH2 和CLT3 三株菌株的抑菌活性最強，對供試柑橘潰瘍病菌的抑菌圈直徑均大于40 mm。室內防效以CLT3 菌株的拮抗效果最突出，相對防效可達83.85%。

經形態學研究，CLT3 與放線菌的形態特征相似，CZR1 和CLH2 兩株菌株的形態特征與細菌的較為相符；采用傳統的生理生化測定結合形態特征觀察，對三株拮抗菌進行了初步分類，結果表明CLT3 為鏈霉菌屬，CLH2 為假單胞菌屬，CZR1 為伯克氏菌屬。

該研究結果說明，從土壤中可以篩選出對柑橘潰瘍病有明顯拮抗作用的菌株，豐富了拮抗菌資源庫。三株菌株所屬的具體種屬、分子生物學特性、殺菌作用機理，以及在自然環境中的田間防效有待進一步研究。

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