液體發酵樹舌提取凝集素的生理學功能檢測

張春玉,宋 凱，劉黎紅，邵佳甲，逯家富

（1.長春職業技術學院食品與生物技術分院，吉林長春 130033；2.東北師范大學生命科學學院，吉林長春 130024；3.長春師范學院生命科學學院，吉林長春 130032）

液體發酵樹舌提取凝集素的生理學功能檢測

張春玉1,2,宋 凱3，劉黎紅1，邵佳甲1，逯家富1

（1.長春職業技術學院食品與生物技術分院，吉林長春 130033；2.東北師范大學生命科學學院，吉林長春 130024；3.長春師范學院生命科學學院，吉林長春 130032）

本文對樹舌菌絲體的深層發酵工藝進行了初步的研究。試驗結果表明，樹舌菌絲體在大豆培養基中培養5天，產出的總蛋白、總糖含量較高。從發酵液中分離和純化出樹舌凝集素具有明顯的生物學活性。

樹舌；液體發酵；凝集素

20世紀60年代，人們就開始從真菌中提取生物活性物質，如多糖、多糖蛋白復合物、凝集素、核糖失活蛋白、多肽、嘌呤和三萜類等，并評價它們的抗腫瘤和抗病毒活性[1-2]。在這種需求下，真菌有效成分的獲取成為研究的熱點[3-5]。

傳統方法都是通過野外采集或是人工栽培種植真菌子實體等，缺點是生長周期長、品質不易控制。1947年，Humfeld發明了深層發酵技術，使真菌具有可工業化大規模生產、產量高、周期短、易于控制、質量穩定、相對容易進行提取分離等優點[6]。本實驗首先以樹舌菌絲體為材料，對其深層發酵工藝的最優化條件進行研究。并對發酵液的有效成分凝集素進行提取分離，通過凝血實驗評價其生理學功能。

1 材料

1.1 菌株

樹舌菌種購自吉林農業大學菌物所。

1.2 培養基

YPG培養基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1（或麥芽糖15 g·L-1），MgSO40.5 g·L-1，KH2PO41 g·L-1。配制固體培養基時加瓊脂粉15 g·L-1。110℃高壓滅菌30min。

不同配比花生和大豆培養基的配制如下表，高壓滅菌30min。

表1 不同培養基的成分配比 g·L-1

2 方法

2.1 接種及培養

樹舌菌種活化培養一周后，切取約1cm2的菌絲體小塊接種到以上6種液體培養基中，26℃搖床中，150rpm振蕩培養，分別重復4組。

2.2 樹舌菌絲體總蛋白含量的測定

（1）分別取每種培養基培養的菌絲體干樣100mg，液氮中迅速研磨成細粉。

（2）加入到1ml預冷的10mMpH 7.4的PBS溶液中，4℃冰箱中放置24 h。

（3）12000rpm離心20 min。

（4）去除上清，將沉淀物用1ml預冷PBS緩沖液重新懸浮、離心。（5）取3和4步驟一次。

（6）BCA試劑盒法測定每種菌絲體中總蛋白含量。

2.3 樹舌菌絲體總糖含量的測定

（1）分別取每種培養基培養的菌絲體干樣100mg，液氮中迅速研磨成細粉。

（2）樣品懸浮于25ml的80%的乙醇溶液中，95℃回流提取4h。

（3）回流后的混合液12000rpm離心20min。

（4）25ml熱水重新溶解沉淀，95℃回流提取2 h。

（5）取混合液12000rpm離心15min，取上清液。

（6）苯酚-硫酸法測定總糖含量。

2.4 樹舌菌絲體總生物量的測定

取一定量的發酵液3000rpm離心10 min。蒸餾水洗滌沉淀后置于55℃烘干稱重。

2.5 樹舌菌絲體發酵液pH值的測定

每天測定發酵液的pH值。

2.6 凝集素粗提液的制備和活性檢測

稱取液體培養的樹舌菌絲體60g（鮮重），加入10mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)置冰箱浸泡24h，經高速搗碎機勻漿后，4層紗布過濾，濾液在3500r/min條件下離心20min，收集上清液，即得粗提液。

2.7 血細胞凝集活性的實驗

按照凝血活性測定法，在“V”型血凝板上，在“V”型血凝板中加入25μl的生理鹽水，取凝集素粗提液（濃度為1mg·ml-1）25μl作倍比稀釋，每孔加入2%的血球懸液。搖動血凝板使溶液混勻，血凝板在室溫放置1.5～2h，顯微鏡下檢測觀察結果。

3 結果與討論

3.1 總蛋白和總糖含量比較

蛋白質和多糖是大型真菌食用和藥用價值的重要成分[7]，本實驗將樹舌菌絲體分別接種于不同成分配比的花生和大豆液體培養基中，對所得的菌絲體的總蛋白含量、總糖含量進行了測定。圖1給出了樹舌在大豆液體培養基中培養時，獲得總蛋白量都略高于或等于在花生培養基中的，且在加入20 g·L-1原料時培養狀態最好，總蛋白含量最高。

圖1 不同濃度配比的大豆和花生培養基培養樹舌中總蛋白含量比較

總糖含量的測定采用苯酚-硫酸方法，并以葡萄糖作標準曲線。將各樣品測得的平均OD值分別代入標準曲線方程，求得總糖的含量。如圖1所示，糖含量的變化與蛋白量變化相一致，大豆培養基要優于花生培養基，且在20 g·L-1原料時培養狀態最好。

圖2 不同濃度配比的大豆和花生培養基培養樹舌中總糖含量比較

3.2 樹舌菌絲體總生物量

參照前面的實驗數據，選取最優的花生培養基（20 g·L-1）進行總生物量的測定。樹舌菌絲體在26℃條件下，110轉/分的轉數在搖床上振蕩培養，其生長曲線近似“S”型（圖3）。接種初期菌絲體生長很快，從第二天就進入對數生長期，直至第五天達到閾值。隨后生長速度放緩，可能是經過生長的最高峰后培養基里的一些菌絲體代謝物產生了抑制的效果。7天后可見呈球狀的菌絲體(圖4)。

圖3 樹舌菌絲體生長曲線

圖4 深層發酵培養的樹舌菌絲體

3.3 樹舌靈芝菌發酵液中pH值的變化

樹舌菌絲體發酵液的pH值變化見圖5，pH值在最初的兩天有略下降的趨勢，到了第三天迅速降低。結合上面的生長曲線分析，是由于在生長旺盛的階段，菌絲體產生大量的酸性物質，直至發酵的第六天，這時菌絲體生長基本穩定，pH值也穩定在4.0～4.5之間。這說明，隨著生長狀態的變化，樹舌菌絲體為了使環境適應自身的生長代謝，對酸堿度進行了自我調節。

圖5 樹舌菌絲體發酵液pH值的變化曲線

3.4 凝血實驗

真菌凝集素的細胞凝集作用是凝集素分子的一個亞基與一個細胞表面的凝集素專一識別的糖基結合，另一個亞基與另一個細胞上的糖基結合，從而通過凝集素的“架橋”作用而導致的本試驗中[8-9]，樹舌菌絲體粗提液經血凝實驗檢測有凝血活性，檢測結果見圖6左側A為實驗樣品，右側B為對照組（以0.9%NaCl作陰性對照）。這表明在這種發酵條件下，獲得的凝集素具有良好的生理學活性。

圖6 凝集素對血細胞的凝血反應的顯微照片

4 結論

本實驗對樹舌菌絲體的液體深層發酵培養工藝進行了優化，通過設定不同氮源、氮源不同含量、不同的發酵時間，對其總蛋白含量、總糖含量進行測定比較，確定了20 g·L-1的大豆培養基最為樹舌菌絲體大規模深層發酵生產更為優良。在這種情況下，發酵的生物量變化和發酵液pH值變化相一致，且發酵5天時，樹舌菌絲體生長狀態最為良好，此時提取凝集素具有明顯的凝血活性。

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Physiologic Function Tests on the Extraction of Lectin from Liquid Fermentation Ganoderma

ZHANGChun-yu1,2,SONGKai3,LIULi-hong1,SHAOJia-jia1,LUJia-fu1
(1.School ofFood Production Technologyand Biotechnology,Changchun Vocational Institute ofTechnology, Changchun 130033,China;2.School ofLife Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China; 3.School ofLife Sciences,Changchun Normal University,Changchun 130032,China)

This paper studies the deep fermentation process of the Ganoderma mycelium preliminarily.Test results showthat after 5 days of cultivation in soybean agar,the Ganoderma mycelium’s total protein and total sugar content is higher,and the lectin ofGanoderma isolated and purified fromfermentation liquid has obvious biological activity.

Ganoderma;liquid fermentation;lectin

O625

A

1008-178X(2012)09-0069-05

2012-06-15

吉林省教育廳項目（2010第480號）。

張春玉(1972-)，女，吉林長春人，長春職業技術學院食品與生物技術分院副教授，博士，從事生物化學與分子生物學研究。