8味中藥對奶牛乳房炎病原菌的體外抑菌試驗

郭 慶，朱 偉，易 瓊，何炳坤，徐賓朋，王 魯

（1．貴州大學貴州省生化工程中心，貴州 貴陽550025；2．安徽科寶生物工程有限公司，安徽 淮北235025；3．貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽550025；4．北京生泰爾生物科技有限公司，北京 昌平102206）

奶牛乳房炎是由各種病因引起的乳房炎癥，該病從發現至今已經有150多年的歷史，給奶牛業造成巨大的經濟損失。致病因素中細菌感染的乳房炎占大多數，主要病原菌包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌等［1－3］。本省奶牛乳房炎的主要致病菌為金黃色葡萄球菌和鏈球菌，所占比例為81．79%［4］。目前，雖已有許多措施用于此病的防治，大多用抗生素、激素和化學合成藥等防治奶牛乳房炎，由于長期使用耐藥菌株增加，內分泌功能紊亂，抗生素殘留和獸藥殘留超標等問題，給畜產品及公共衛生帶來危害［5－6］。中草藥是純天然物質，具有抗菌、消炎、低毒和細菌不易產生耐藥性等特點，應用中草藥替代抗生素防治奶牛乳腺炎，已日益為國內外學者所認識。本試驗采用試管二倍稀釋法，比較8味中藥對3種主要致病菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度，旨在篩選出效果最好的中藥，為研制治療奶牛乳房炎方劑提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 中藥 金銀花、蒲公英、連翹、芙蓉花、瓜蔞、大黃、黃芪、當歸均為生藥，購于貴陽市云巖區頭橋中藥店，經貴州大學中藥實驗室鑒定。

1．2 試驗菌株 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌，均由貴州大學預防獸醫學實驗室自貴陽某奶牛場患有隱性乳房炎牛奶中分離、鑒定提供。

1．3 儀器 HH－4數顯恒溫水浴鍋；DL－360B智能超聲波；微量移液器；LD4－2低速離心機；LDZX－50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌器；RE－52旋轉蒸發儀；HH－B11－500型電熱恒溫培養箱；SW－CJ－1F單人雙面凈化工作臺。

1．4 試劑及培養基 牛肉浸膏、蛋白胨、瓊脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨，購自貴州賽蘭博生物科技有限公司；石油醚、酒精等均為分析純；普通肉湯培養基、普通瓊脂培養基、LB培養基，參照文獻［7］制備。

1．5 中藥液制備 將金銀花、蒲公英、連翹等分別準確稱取100g，用70%乙醇浸泡30min（料液比10∶1），然后超聲15min，回流提取第1次2h，用16層紗布過濾倒出藥液。藥渣再加70%乙醇（料液比8∶1），第2次1h，倒出藥液，合并2次濾液，旋轉蒸發至無醇味，加入石油醚萃取，水相濃縮至1 g／mL，3 000r／min離心10min，取上清液，121℃流通蒸汽滅菌15min。滅菌后4℃保存備用。

1．6 試驗菌株的準備 將試驗菌株復壯、活化后接種普通肉湯培養基和LB培養基中，置于恒溫培養箱37℃培養18～24h，比濁管比濁至0．5個麥氏比濁管（1%BaCl20．5mL，1%H2SO499．5mL），即將菌液配成1．5×108CFU／mL，備用。

1．7 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度的測定（MBC）試驗 采用試管二倍稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）：操作全部在超凈工作臺內進行。（1）取加塞無菌小試管9支，每管中加入制好的普通肉湯培養基1mL，在第1管加中藥1mL，用微量移液器混勻，吸取1mL至第2管混勻，依次到第7管，第8管做陽性對照（加菌液不加中藥），第9管做陰性對照（加中藥不加菌液）。（2）加稀釋好的菌液0．1 mL，第9管不加菌液。此時1號到7號管內藥液的濃度分別相當于500mg／mL、250mg／mL、125mg／m、62．5mg／mL、31．25mg／mL、15．63mg／mL、7．81mg／mL生藥濃度，8號管作陽性對照管，9號管作陰性對照管。（3）將各組試管置37℃恒溫培養箱中培養18h，觀察記錄結果。與對照組比較，有絮狀沉淀的管則為有細菌生長，無絮狀沉淀的管為細菌生長受抑制管，以肉眼觀察無絮狀沉淀管的最低藥物濃度作為該藥的最低抑菌濃度（MIC）。（4）重復1至3步，試驗結果取3次的平均值。（5）結果的判斷標準：由于中草藥對細菌的MIC國內目前尚無統一的標準，本試驗參照同類試驗［8］的標準作為判斷標準。即當MIC＜7．81mg／mL生藥濃度時為高度敏感；當 MIC在15．63～62．5mg／mL生藥濃度時為中度敏感；當 MIC為62．5～250．00mg／mL生藥濃度時為較敏感；當MIC＞250．00mg／mL生藥濃度時為不敏感。測出最低抑菌濃度（MIC）后，再依次從未見細菌生長的各試管培養物中取一接種環，接種于不含藥的普通瓊脂平板上，輕輕攤開菌液，37℃培養24h，觀察有無細菌生長。普通瓊脂平板中，生長的菌落數小于5個菌落的藥液最低濃度，即為最低殺菌濃度（MBC）。

2 結果

8味中藥對3種致病菌的體外最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定結果見表1。

表1 中藥對3種致病菌的MIC和MBC （mg／mL）

從表1中可以看出，金黃色葡萄球菌對金銀花、蒲公英、連翹、大黃中度敏感；芙蓉花、黃芪次之；大腸桿菌對芙蓉花中度敏感；金銀花、蒲公英次之；無乳鏈球菌對芙蓉花中度敏感；除黃芪不敏感其余為較敏感。

3 討論

3．1 本試驗所用菌株直接從患病奶牛乳中分離并鑒定，用中草藥提取物對3種細菌的抗菌活性進行測定，其結果更有說服力。從本次試驗結果可知，中草藥對這3種細菌的抗菌活性與文獻報道［9－11］相一致。中藥的產地，不同細菌分離菌株和毒力是影響中藥體外抑菌試驗結果的重要因素。

3．2 本試驗采用乙醇回流提取法提取藥液來測定其抑菌效果，效果最好的芙蓉花對3種致病菌體外最低抑菌濃度分別為 62．50mg／mL、31．25mg／mL、15．63mg／mL。金銀花、連翹對金黃色葡萄球菌體外抑菌效果最好，濃度均為15．63mg／mL。從本次試驗結果可知，芙蓉花、金銀花、連翹可作為防治奶牛乳腺炎制劑的主藥，但與其他藥物之間的配伍作用及其體外藥理作用還需要進一步研究。

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