針刺治療腦梗死對神經元保護作用機制的實驗研究

何娜 朱春雷 何欣

關于腦梗死的治療方法很多，作為傳統醫學的針刺治療法以其獨有的優勢倍受青睞。以往研究表明：針刺對腦缺血的治療作用是通過減少腦缺血后神經元壞死實現的。近來研究發現，針刺對腦缺血后神經元的凋亡亦有抑制作用。本實驗應用免疫組化的方法，對針刺治療腦梗死后梗死灶周圍組織中的細胞凋亡蛋白Bcl-2與Bax在24h的變化進行檢測，從而為針刺治療對抗腦缺血損傷作用機制的研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠30只，體重200～250g之間（由吉林大學實驗動物中心提供）。隨機分為假手術組、缺血組和針刺組，每組10只。

1.2 主要試劑及儀器 Bcl-2鼠抗人單克隆抗體和Bax兔抗人多克隆抗體(美國Sant Cruz公司)，稀釋度分別為1:50和1:150；SP試劑盒(美國Zymed公司)；SDZ-Ⅱ型電針治療儀（華佗牌，上海醫用儀器廠）；1%戊巴比妥。

1.3 方法 大腦中動脈梗死模型的建立:除假手術組外，各組均根據改良的Koizumi[1]線栓法制作大鼠MCAO(大腦中動脈阻斷)模型。待大鼠清醒后選用Bederson[2]的方法觀察大鼠的體征，出現下列體征表明模型制作成功：①右側出現horner征；②左前肢癱瘓，將鼠尾提起大鼠不能充分伸展左前肢，當大鼠左旋時左前肢拖在腹下，與右前肢交叉成剪刀狀。

穴位定位與電針方法:根據動物穴位圖譜[3]，選取動物模型的外關和足三里兩穴。分別于造模后15min進行30min電針干預，針刺深度1mm；以醫用1寸毫針針刺入相應穴位，于針柄處接SDZ-Ⅱ型電針治療儀。刺激參數：疏波4HZ，密波20HZ，脈沖寬度0.5ms；輸出電壓2～4V，輸出電流4～6mA，強度以鼠尾輕顫為度。極性固定，負極接右側足三里或外關穴，正極接鼠尾。假手術組與缺血組均不給予任何刺激。于造模24h后分別將動模處死斷頭剝離其腦組織，置于10%福爾馬林中固定，脫水經矢狀位切開，取大腦皮層進行石蠟包埋，制成厚度為5μm連續矢狀切片備用。

動物模型的腦神經細胞Bcl-2和Bax的檢測具體操作步驟參照試劑盒說明。

1.4 結果判定 陽性值為細胞內出現棕黃色三角型或彎月型顆粒，即有Bcl-2和Bax蛋白表達。鏡下觀察，在10×20倍視野下隨機記數5個視野的陽性細胞總數或陽性細胞百分率，取其均值。主要觀察指標：造模后24h，各組大鼠腦細胞凋亡蛋白的表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS11.0軟件包進行處理分析，數據均以±s表示。

2 結果

2.1 實驗動物數量分析 驗選取Wistar大鼠30只，全部進入結果分析，中途無脫落。

2.2 顯微鏡觀察 ①假手術組僅見微量陽性細胞散在分布（圖a，圖d）,無顯著意義(P＞0.05)；②針刺組與缺血組(圖b，圖e)鏡下可見陽性細胞，以針刺組陽性細胞數的表達最為明顯(圖c，圖f)。經統計學分析：針刺組Bcl-2、Bcl-2／Bax的表達均明顯高于假手術組和缺血組(P＜0.01)；Bax的表達顯著低于缺血組(P＜0.01)，與假手術組基本相似(P＞0.05)。

表1 針刺對Bcl-2和Bax在皮質內的表達的影響(n=10;±s)

表1 針刺對Bcl-2和Bax在皮質內的表達的影響(n=10;±s)

注：aP＜0.05與假手術組比較。

組別 n Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax假手術組 10 7.3±1.3 7.2±1.8 1.11±0.17缺血組 10 10.8±2.5 20.8±2.3a 0.52±0.06a針刺組 10 15.8±2.2 11.7±1.8 1.36±0.02

圖1：假手術組 頂葉皮質Bax蛋白的表達；（SP法，×200） 圖2：缺血組 頂葉皮質Bax蛋白的表達；（SP法，×200） 圖3：針刺組 頂葉皮質Bax蛋白的表達；（SP法，×200）

圖4：假手術組 頂葉皮質Bcl-2蛋白的表達；（SP法，×200） 圖5：缺血組 頂葉皮質Bcl-2蛋白的表達；（SP法，×200） 圖6：針刺組 頂葉皮質Bcl-2蛋白的表達；（SP法，×200）

3 討論

針刺治療腦梗死抑制神經細胞凋亡逐漸成為值得關注的熱點問題。實驗證明，針刺對腦缺血時神經細胞凋亡有明顯的抑制作用[4]。電針“百會”和“水溝”穴可部分抑制局灶性腦缺血腦內c-fos表達[5]；醒腦開竅針刺法可增加梗死區皮質、紋狀體、海馬hsp70基因的表達[6]；針刺“內關”、“百會”、“水溝”穴可明顯減輕局灶性腦缺血損傷，提高P53 蛋白的表達從而抑制細胞凋亡[7]等。

細胞凋亡（apoptosis）又謂細胞程序化死亡（programmed cell death,PCD）是一種參與生物體許多過程的細胞去除機制，由基因編程調控的細胞主動自殺過程。隨著缺血時間的延長梗死灶擴大，在梗死灶的邊緣區域以細胞凋亡為主，在梗死中心區以細胞死亡為主。 在Bcl-2家族中有眾多成員，如Mcl-1、NR-B、A1、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等，分別有抗凋亡或促凋亡作用。多數成員間有兩個結構同源區域，在介導成員之間的二聚體化過程中起重要作用。研究表明Bcl-2有抑制細胞凋亡，延長細胞壽命的作用，而Bax功能與Bcl-2功能相反，Bax和Bcl-2表達比率決定細胞是否會發生凋亡[8]。

通過觀察大鼠MCAO模型建立后針刺外關、足三里兩穴，于24h處死大鼠，運用免疫組化法觀察細胞凋亡蛋白Bcl-2與Bax在腦細胞內的變化。結果表明當腦梗死發生后，啟動腦神經細胞凋亡機制。在假手術組中可見微量陽性細胞散在分布,無顯著意義；針刺組與缺血組鏡下可見陽性細胞，其中以針刺組陽性細胞數的表達最為明顯；針刺組Bcl-2、Bcl-2／Bax的表達均明顯高于假手術組和缺血組；Bax的表達顯著低于缺血組，與假手術組基本相似。證明針刺治療腦梗死可升高Bcl-2和降低Bax的表達，從而抑制腦細胞的凋亡，挽救缺血半暗帶向正常腦組織的轉化，改善神經功能的作用。

[1]Koizumi T,Yoshida Y,Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edema.A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Jpn J Stroke,1986,8:1.

[2]Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of themodel themodel and development of a neurologic evaluation[J].Stroke,1986,17:472.

[3]李忠仁.實驗針灸學[M].北京：中國中醫藥出版社,2003:327-329.

[4]晏義平,孫鳳艷.電針對大鼠腦缺血后腦內神經細胞凋亡的影響[J].針刺研究,1998,23(1):33-35.

[5]董勁松,陳伯英.即早表達基因c-fos在電針抗局灶性腦缺血損傷中作用的研究[J].針刺研究,2001,26(2):97-101.

[6]馬巖 ,王舒,魯斌,等.醒腦開竅針刺法干預實驗性腦梗塞大鼠熱休克蛋白基因表達的研究[J].中國針灸,2001,21(2):107-112.

[7]余曉慧,孫國杰.針刺對局灶性腦缺血大鼠p53蛋白表達的影響[J].中國中醫急癥,2003,12(6):557-557.

[8]郭新慶,薛愛琴,吳穹,等.70味珍珠丸對全腦缺血/再灌注大鼠海馬CA1區神經元的保護作用[J].當代醫學,2010,17(25):1-2.