固氮菌的篩選及其對菜場垃圾堆肥化的影響

王曉輝，姜 虎，刁 婥，張立菲，張 穎*

（1.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省環境保護科學研究院，哈爾濱 150056）

隨著城市化進程加快，環境問題，特別是城市生活垃圾處理問題已成為關注焦點。直接傾倒和簡易填埋處理方式對土壤、地下水、大氣等都會造成現實的影響和潛在危害。特別是填埋場的滲瀝水，由于未進行必要的收集和處理，導致水源污染。垃圾填埋場污染地下水源，嚴重污染、破壞垃圾填埋場周邊環境的情況時有發生。如何解決垃圾問題，已引起全社會的高度重視[1]。

堆肥是目前廣泛應用且能有效處理城市生活垃圾的方法之一，其實質就是利用微生物在一定溫度、濕度和pH條件下，使城市有機物質發生生物化學降解，形成一種類似腐殖質土壤的物質，用作肥料和改良土壤。堆肥化的產物稱為堆肥。堆肥是一種深褐色、質地松散、有泥土味的物質。這種物質的主要成分是腐殖質，其養料價值不高，是一種極好的土壤改良劑和調節劑。城市生活垃圾在堆肥過程中往往會損耗大量的氮，使其含量大大降低。然而，氮是農作物生長的三大要素之一，對提高農作物的產量具有重要意義[2]。

石春芝等曾嘗試在堆肥中加入固氮菌和纖維素分解菌，利用兩者的互生作用（纖維素分解菌可將堆肥中的一些枯枝、落葉、樹皮、朽木等有機組分分解成化學結構簡單的物質，為固氮菌提供碳源）來提高堆肥的含氮量，從而提高堆肥的肥效[3]。但其只是初步嘗試，所用菌種為廣東省微生物研究所直接提供的褐球固氮菌，未對菌種進行篩選。陳世和等曾對城市生活垃圾堆肥過程中的主要微生物的分離、鑒定和酶活力進行研究[4]。本試驗從土壤中篩選出優勢固氮菌，在菜場垃圾中加入這些固氮菌，利用其生物作用來提高堆肥的含氮量，從而提高堆肥質量，縮短堆肥周期。

1 材料與方法

1.1 固氮菌的篩選

1.1.1 原理

自生固氮菌具有固氮能力，能在無氮培養基上生長繁殖。取pH 6.5以上的耕作土壤，經過適當處理后，加入到無氮培養基上，在適合的溫度下培養3 d，在平板表面就會出現褐色、粘稠、半透明的菌落。加1%淀粉可促進褐球固氮菌的生長，而維涅蘭德固氮菌則是該屬中唯一能利用鼠李糖的固氮菌。如加入蔗糖并調pH 5～6的范圍時可促進拜氏固氮菌的生長。最后挑取典型的菌落，在無氮培養基平板上經過數次劃線便可得到純種的單菌落。

1.1.2 材料

樣品：上海師范大學校園泥土。

培養基：阿須貝（Ashby）無氮培養基。

1.2 堆肥化的處理方法[5]

1.2.1 擴大培養

分別將各培養基上的菌種接種于盛有300 mL對應碳源的Ashby培養液的三角瓶中，在28℃下振蕩培養3 d，待培養液混濁。將得到的三種菌種及它們的混合菌種分別倒入裝有菜葉的桶中。具體方法如下：塑料桶裝菜葉10 kg，大小約為8 cm×5 cm，以5%的接種量接種。接種后將塑料桶置于室溫下，早晚各攪動1次，并保持濕潤。間隔3 d用下述方法對堆肥的全氮，銨態氮和硝態氮的含量進行測定。具體的處理方法見表1。

表1 具體處理方法Table1 Treatment methods of the compost

1.3 全氮，硝態氮，銨態氮的測定[6]

樣品中全氮量的測定：半微開氏法（K2SO4-CuSO4-Se蒸餾法）；樣品中銨態氮含量的測定：蒸餾滴定法（2NKCl浸提-蒸餾法）；樣品中硝態氮含量的測定：酚二黃酸比色法

1.4 固氮菌降解菜場垃圾中微生物數量的變化處理過程中的數量分析[7]

稀釋涂布法：分別用牛肉膏蛋白胨培養基、高氏I號培養基、查氏培養基和豆芽汁培養基培養分離計數細菌、放線菌、霉菌和酵母菌。

分別用以淀粉、鼠李糖、蔗糖和葡萄糖為唯一碳源的無氮培養基培養分離計數褐球固氮菌、維涅蘭德固氮菌、拜氏固氮菌以及它們的混合固氮菌。

2 結果與分析

2.1 篩選出的菌株

結果見表2，由表2可見，2.1%淀粉可促進褐球固氮菌的生長，維涅蘭德固氮菌則是該屬中唯一能利用鼠李糖的固氮菌，加入蔗糖并調pH 5～6時可促進拜氏固氮菌的生長。我們在3組無氮培養基中加入不同碳源，即1%淀粉，鼠李糖，蔗糖并將pH值調至5～6，所以我們分別得到3種菌種即褐球固氮菌，拜氏固氮菌及維涅德蘭固氮菌。褐球固氮菌和拜氏固氮菌菌落數相似，維涅德蘭固氮菌的菌落數明顯少于褐球固氮菌和拜氏固氮菌。

2.2 五組堆肥裝置中含氮量的變化

2.2.1 全氮含量的變化

全氮的含量隨時間變化見圖1。由圖1中可知接種混合固氮菌的堆肥裝置中的全氮含量最高，接下來依次為褐球固氮菌，拜氏固氮菌，維涅蘭德固氮菌，最后是空白，且各組的全氮含量呈上升趨勢從第7天開始趨于穩定。

表2 篩選得到的菌株Table2 Results of selected strains

圖1 全氮含量的變化Fig.1 Changes of total nitrogen

2.2.2 銨態氮含量的變化

在反應進行中，銨態氮的含量隨時間的變化見圖2。從圖2中可知接種混合菌種的堆肥裝置中的銨態氮含量最高，接下來依次為褐球固氮菌，拜氏固氮菌，維涅德蘭固氮菌，含量最低的為空白。且各組中的銨態氮含量均呈上升趨勢但從第7天開始下降而到第13天后趨于穩定。

2.2.3 硝態氮含量的變化

硝態氮的含量隨時間的變化見圖3。

由圖3可知，接種混合固氮菌的堆肥裝置中的硝態氮含量最高，接下來依次為褐球固氮菌，拜氏固氮菌，維涅蘭德固氮菌。含量最低的為空白。各組中硝態氮含量都呈上升趨勢，到第13天開始趨于穩定。

圖2 銨態氮含量的變化Fig.2 Changes of ammonium nitrogen

圖3 硝態氮含量的變化Fig.3 Changes of nitrate nitrogen

2.2.4 堆肥過程中菜葉的變化情況

接種混合菌種的菜葉5 d后周邊開始糜爛，12 d后菜葉已基本糜爛，接種褐球固氮菌、拜氏固氮菌、維涅蘭德固氮菌的菜葉分別在7、9、10 d后菜葉周邊開始糜爛，14、17、19 d后菜葉基本糜爛。而未接種固氮菌的菜葉（空白）一直到實驗結束即21 d后都未見糜爛。說明混合菌種的堆肥周期最短，接下來依次為褐球固氮菌、拜氏固氮菌、維涅蘭德固氮菌。

3 討論與結論

在固氮菌的作用下，接種混合固氮菌的堆肥中銨態氮、硝態氮含量增加最多，接下來依次為褐球固氮菌、拜氏固氮菌、維涅蘭德固氮菌。由于第五組堆肥中加了混合固氮菌后，三種固氮菌共同作用于菜葉，所以其堆肥中氮含量要比其他組的多。

在低溫堆肥初期，五組堆肥中氮含量的變化趨勢相似。空白組中未加固氮菌，但其全氮，銨態氮、硝態氮含量增加。

在堆肥中期，銨態氮含量的、降低，而硝態氮的含量增加可能是由于一部分銨態氮轉化為氨類物質從堆肥中逸出；一部分銨態氮轉化為硝態氮，進而轉化為有機氮。接種固氮菌的堆肥中，固氮菌大量生長繁殖，使堆肥中的硝態氮、銨態氮含量比空白組多。接種褐球固氮菌的堆肥中的全氮，銨態氮，硝態氮的含量要比接種拜氏固氮菌，維涅蘭德固氮菌高。

堆肥中全氮、銨態氮、硝態氮含量變化及堆肥周期說明混合菌種的堆肥效果比單一菌種堆肥效果好，其中褐球固氮菌的堆肥效果比拜氏固氮菌及維涅蘭德固氮菌好。

在堆肥物料中加入自生固氮菌提高堆肥中的含氮量和堆肥肥效。而固氮菌本身具有的生物活性增加肥料的生物學性能，將其施用于土壤，增加土地肥力和土壤中的功能微生物數量，有利于土壤中物質分解與轉化，改良土壤，保護環境。

[1]臧又超.我國城市生活垃圾現狀與管理問題[J].環境保護,1998(8):41-43.

[2]Tang Y J.Research of the refuse and its treatment in Shanghai City[J].Chongqing Environ Sci，1997,19(2):30-32.

[3]石春芝,蒲一濤,鄭宗坤,等.垃圾堆肥固氮菌對堆肥含氮量的影響[J].應用與環境生物學報,2002,8(4):419-421.

[4]陳世和,張所明,宛玲,等.城市生活垃圾堆肥處理的微生物特性研究[J].上海環境科學,1989,8(8):17-21.

[5]Chen H B,Tao H,Feng Q L,et al.Study for the status quo of municipal refuse disposal in China[J].J Wuhan Urban Construct Instit,1997,14(3):40-44.

[6]Pu Y T,Zhong Y H,Zhou W L.The mixed culturing of nitrogen-fisation bacteria and cellulose decomposing organism and the effects on the decomposing of the household garbage[J].Eniviron Sci Technol,1999,84(1):15-18.

[7]沈萍,范秀容,李廣武.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,1999(6):214-215.