野生靈芝菌種培養基篩選的研究*

袁學軍，李艷麗，陳永敢，張 恒

（瓊州學院生物科學與技術學院，海南 三亞 572000）

靈芝 (Ganoderma lucidum)隸屬真菌門 (Eumycota)，擔子菌亞門 (Basidiomycotina)，層擔子菌綱 （Hymeno mycetes）,無隔擔子菌亞綱 (Holobasidiomycetidae)，非褶菌目 (Aphyllophorales)[1]。靈芝主要分布在亞洲、澳洲、非洲及美洲的熱帶及亞熱帶，少數分布于溫帶。地處北半球溫帶的歐洲僅有靈芝屬的4種，而北美洲大約5種。我國地跨熱帶至寒溫帶，靈芝科種類多而分布廣[2]。海南島地處北半球熱帶區，其豐富的水熱資源和復雜的地形條件，有利于靈芝真菌的生長繁殖，這就決定了海南島靈芝資源是國內外最豐富的地區，在我國靈芝在海南的分布種類最多，計78種,分屬4屬、3亞屬、2個組[3]，占全國靈芝科的53.6%[2]。

靈芝的生物活性成分十分豐富，豐富的生物活性成分決定了它功能的多樣性[4]。據有關研究表明，目前已分離到靈芝的150余種活性成分，有多糖類、核苷類、生物堿類、氨基酸、蛋白質類、三萜類和礦質元素等[5]，具有抗腫瘤、保肝解毒、預防心血管系統疾病、抗過敏、抗衰老、抗神經衰弱、治療高血壓、慢性支氣管炎、支氣管哮喘等作用[6]。除醫學外，靈芝在食品、飲品以及保健品產業都占有一定的市場與地位，具有較高的觀賞價值及經濟價值[7]。靈芝既不同于一般藥物對某種疾病起治療作用，亦不同于一般營養保健食品只對某一方面營養素的不足進行補充和強化，它的獨特之處主要在于它是在整體上雙向調節人體機能平衡，調動機體內部活力，調節人體新陳代謝，提高自身免疫能力，促使全部的內臟或器官機能正常化，從而從根本上達到治病強身保健的目的[6]。

近年來，靈芝的開發利用越來越受到人們的重視，消費量增長很快，種植面積不斷擴大，但存在著菌種成活率低、發菌慢、結皮老化、出芝表面木栓化、生物轉化率低、成本高、質量不穩定等現象，造成經濟效益不高[8]。造成這些現象的主要原因是菌種質量差[9]。能否培育優質菌種的關鍵是適宜的培養基配方[10]。本實驗設計多個菌種培養基配方,篩選出最適于靈芝培養的母種培養基、原種培養基、栽培種培養基配方，為了能夠更有效地進一步研究和開發利用真菌資源奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種:7號五指山地區野生靈芝

1.1.2 藥品材料:馬鈴薯、瓊脂、葡萄糖、蔗糖、木屑、麥麩、棉籽殼、石膏、75%酒精、95%酒精。

1.2 方法

1.2.1 培養基配方

母種培養基的配方:

（1）PDA：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、1 000 mL； （2）PSA：馬鈴薯 200.0 g、 蔗糖 20.0 g、瓊脂 20.0 g、 水 1 000 mL； （3）PDA+K++Mg2+：馬鈴薯200.0 g、 葡萄 糖 20.0 g、 瓊脂 20.0 g、KH2PO43 g、Mg SO41.5 g、1 000 mL； (4)PDA+木屑： 馬鈴薯200.0 g、 葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、100 g木屑取汁1 000 mL；

原種和栽培種培養基的配方:

（1） 木屑 990 g、 石膏 10 g和水 1 300 mL； （2） 木屑790 g、 麥麩200 g、 石膏 10 g和水 1 300 mL； （3） 棉籽殼790 g、 麥麩 200 g、 石膏 10 g和水 1 300 mL； （4）棉籽殼990 g、石膏10 g和水1 300 mL。

1.2.2 培養基的制作與培養

母鐘按常規方法制作平板培養基，121℃，滅菌20min，培養基滅菌之前pH調整為6.5，總共4個處理，每個處理4個重復。

原種和栽培種按常規方法制，原種用瓶，栽培種用袋，121℃，滅菌2 h，培養基滅菌之前pH調整為6.5，總共4個處理，每個處理4個重復。

培養的條件為：室溫 （25±2）℃，濕度為60%～65%，黑暗。

1.2.3 測量和觀察的指標

母鐘第7天時測量菌絲的速度 （生長速度/cm·d-1=菌絲長度cm/d），觀察菌絲的粗度 （粗、中等、細）、生長勢（強、中等、弱）、疏密程度 （較密、密、疏）、顏色。

原種和栽培種第12天時測量菌絲的速度，觀察菌絲的粗度 （較粗、粗、細、較細）、生長勢 （較強、強、弱、較弱）、疏密程度 （較密、密、疏、較疏）、顏色。并記錄長滿瓶和袋的天數。

1.2.4 統計分析

用南京農業大學王韶華教授發明的stst軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基配方對母種生長的影響

圖1 不同培養基配方對母種菌絲生長的影響

表1 不同培養基配方對母種生長的影響

不同培養基配方對母種菌絲生長的影響 （圖1和表1），結果顯示在4種培養基上菌絲的生長速度存在極顯著性差異，靈芝菌絲在PDA+木屑培養基上生長速度最快，其生長速度為1.213 cm·d-1，菌絲較細、較密、純白、生長勢最強；在PDA培養基上生長速度次之，其生長速度為1.15cm/d，菌絲細、密、純白、生長勢強；在PSA培養基上生長速度較慢，菌絲較粗、疏、純白、生長勢弱；PDA+K++Mg2+培養基上，生長速度最慢，菌絲體較粗、較疏、純白、生長勢最弱。

圖2 不同培養基配方對原種生長的影響 （第12d）

表2 不同培養基配方對原種生長的影響

因此，根據綜合指標，PDA+木屑培養基為母種最佳培養基。

2.2 不同培養基配方對原種生長的影響

圖2和表2顯示，靈芝菌絲在棉籽殼培養基上的生長速度最快，其生長速度為4.778 mm·d-1，菌絲最粗壯、濃密、純白，但是滿瓶后出現了發黃現象，滿瓶時間為16 d；在棉籽殼+麥麩培養基上生長速度為4.052 mm·d-1，生長速度次之，菌絲較粗壯、濃密、純白，滿瓶后無發黃現象，滿瓶時間為20 d；木屑+麥麩培養基的生長速度較慢，其生長速度為3.657 mm·d-1，菌絲粗壯，稍稀疏，純白，滿瓶后無發黃現象，滿瓶時間為23 d；木屑培養基的生長速度最慢，剛開始生長情況不良，幾乎不長，其生長速度為2.453 mm·d-1，滿瓶時間為32 d。綜合各種指標棉籽殼培養基更適合靈芝的培養，但是棉籽殼培養基后期容易發生黃化現象，在生產中要注意及使用。

圖3 不同培養基配方對栽培種生長的影響

3 不同培養基配方對栽培種生長的影響

靈芝在棉籽殼培養基上的生長速度最快，其生長速度為4.366 mm·d-1，滿袋時間為40 d；棉籽殼+麥麩培養基上的生長速度次之，其生長速度為3.796mm·d-1，滿袋時間為45 d；木屑+麥麩培養基的生長速度較慢，其生長速度為3.269 mm·d-1，滿袋時間為51 d；木屑培養基的生長速度最慢，剛開始生長情況很不好，幾乎不長，其生長速度為2.135mm·d-1，滿袋時間為61 d。綜合各種指標，栽培種最適培養基為棉籽殼，結果和原種培養基類似。

表3 不同培養基配方對母種生長的影響

4 討論與結論

菌種質量的好壞直接影響到栽培能否成功和產量、質量，菌種的質量受多種因素的影響，但最關鍵因素為培養基的營養狀況，因此，培養基的選擇具有重要意義。

母種質量的標準： （1）轉管次數：最多不超過4次~5次； （2）菌齡：低溫保存不超過6個月； （3）外觀：菌絲濃白、粗壯、富有彈性、爬瓶力強，沒有干燥、收縮現象和大量紅褐色液體； （4）長勢：菌絲生長快、整齊、濃而健壯； （5）溫度適應性：在適溫培養后，放在高溫下培養幾小時，菌絲仍能健壯生長的； （6）干濕性鑒定；（7）出菇試驗。原種和栽培種的質量標準： （1）菌絲生長健壯，絨狀菌絲多，生長整齊； （2）菌絲己長滿培養基，有的要求有分化的子實體原基。有菇香味，無異味；（3）菌絲色澤潔白或符合該菌的顏色； （4）菌種瓶內無雜色出現和無雜菌污染； （5）菌種瓶內無黃色汁液滲出；（6）菌種培養基不能干縮與瓶壁分開。

在本試驗中靈芝菌絲在PDA+木屑培養基上生長良好，可能是由于靈芝屬木腐型真菌，在PDA+木屑培養基中，木屑過濾液可提供木質中的營養；在菌絲生長過程中，必須提供充足且均衡的營養，菌絲才能生長良好，營養缺乏后過剩都影響菌絲的生長，在本試驗中，純木屑培養基營養缺乏，菌絲生長不良。但棉籽殼本身營養豐富，已經能滿足菌絲的生長，在加入麥麩后由于營養過剩，菌絲反而生長不良。

總之，依據菌種質量標準，綜合各種試驗指標，野生靈芝母種最佳培養基為PDA+木屑培養基，原種和栽培種最佳培養基均為棉籽殼，本試驗為生產優質的靈芝菌種提供可靠的參考依據。

[1]趙繼鼎．中國靈芝新編[M]．北京：科學出版社，1989．

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[10]初洋，倪新江．靈芝培養基的篩選 [J]．安徽農業科學,2008,36（5）：1924-1925.