響應面法優化大腸桿菌CD－2產偶氮還原酶培養基的條件1)

杜光映輝 崔岱宗 張 寧 趙 敏 李國芳 古曉旭

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

印染和染料工業是對環境污染極其嚴重的產業之一。我國年產染料為15萬t［1］，偶氮染料產量占染料總產量的70%左右［2］，在偶氮染料的生產和使用中有10% ～15%的染料隨廢水排入水系中［3］，導致嚴重的水污染，引起了人們的廣泛重視。偶氮染料是含有一個或多個偶氮鍵(—N=N—)的有機合成染色劑，目前廣泛地應用于紡織、食品、藥品等工業中［4］。然而，偶氮染料在水環境中可以長期穩定存在，更為嚴重的是大部分偶氮染料及其降解產物具有致畸、致癌、致突變的作用［5］。這些偶氮染料的降解產物如果長期蓄積并通過污染的水源和食物經口進入體內，會引起人類的各種疾病。因此，含偶氮染料的廢水必須經過處理才能排到水系中［6］。目前處理含偶氮染料廢水的工藝主要有物理法、化學法，如吸附、沉淀、化學氧化等，但由于這兩種方法的低效和高成本，不能大規模應用到實際的污水處理中。生物法克服了這些缺點，在處理含偶氮染料廢水中有明顯的優勢，已受到人們越來越多的關注［7－8］。生物法降解含偶氮染料廢水的高效、環保和低成本優勢使其具備了大規模應用的潛力。目前，對生物降解偶氮染料的研究主要集中在環境中各種微生物對偶氮染料的生物吸收和降解。近年來，能夠在厭氧條件下高效降解偶氮染料的細菌，如Bacillus sp.、Klebsiella sp.等陸續被分離［9］出來，然而，厭氧條件下偶氮染料不能被完全降解，其生成的中間產物芳香胺類物質仍對環境有較大危害。所以有必要對偶氮染料在好氧條件下進行徹底降解的可能性進行深入研究。

筆者曾從中國海城市某紡織廠印染廢水中發現并分離了一株能夠在好氧條件下有效降解偶氮染料的細菌，經生理生化特性鑒定及16S rDNA基因序列分析確定為大腸桿菌，命名為E.coli CD－2，該菌能在好氧條件、較寬的溫度、pH值和鹽度范圍下有效地降解多種偶氮染料。因此，菌株CD－2有巨大的潛力應用于含偶氮染料的廢水處理中。本文通過前期試驗對影響菌株CD－2的產偶氮還原酶培養基單因子條件進行了篩選和水平分析，并利用響應面法(RSM)對大腸桿菌CD－2的產偶氮還原酶培養基條件進行了優化，以提高大腸桿菌CD－2產偶氮還原酶的效率，為其能夠進一步應用于偶氮廢水處理打下堅實基礎。

1 材料

菌種 研究所用菌株是從中國海城市某紡織廠印染廢水中分離出來的，經生理生化特性鑒定及16S rDNA基因序列分析確定為大腸桿菌，命名為Escherichia coli CD－2。

培養基與試劑 富集培養基:Luria－Bertani(LB)培養基;單因子優化后的初始降解培養基:甘露醇 10 g·L－1、氯化銨 3 g·L－1、接菌量 2%、KH2PO45 g·L－1、Na2HPO45 g·L－1、MgCl21 g·L－1、甲基紅100 mg/L、pH 值為6.0;NADH 購自 Sigma公司，其他試劑均為國產分析純。

2 試驗方法

菌種培養 接種Escherichia coli CD－2于100 mL LB培養基中，120 r/min，37℃培養12 h。以2%接種量接種到150 mL待優化的培養基中。120 r/min，37 ℃培養14 h。

偶氮還原酶粗酶液的提取 將上述培養過的菌液10000 r/min離心5 min后去上清收集菌體，用100 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)清洗兩次，離心后用5 mL同樣的磷酸緩沖液重懸菌體，用超聲波破碎法(5 s，80%輸出功率，50次破胞)對重懸液進行破胞處理。破碎完的重懸液10000 r/min離心15 min得到的上清即為粗酶液。

偶氮還原酶直接酶活的測定 2 mL酶活測定體系包括:0.2 mL 粗酶液、0.2 mol/L 染料、1.6 mL 100 mmol/L 磷酸緩沖液(pH=7.0)、0.2 mL 1 mmol/L的NADH，未加NADH前37℃溫浴4 min，從加入NADH時開始計時，調至染料相應波長處測降解值，(經過全波長掃描，甲基紅波長定為407 nm)一個酶活單位定義為:1 mL體系中1 min能降解1 mol染料所需要的酶量。

PB和響應面對產酶培養基進行優化 通過單因子試驗對碳源、氮源、無機鹽、pH和接菌量進行篩選，得出最佳碳源為甘露醇10 g·L－1，最佳氮源為氯化銨 5 g·L－1，最適無機鹽為:KH2PO45 g·L－1、Na2HPO45 g·L－1、MgCl21 g·L－1，最佳 pH 為 6，最佳接菌量為3%。以上述單因子試驗得出的各個因子的最佳量為中心點取高水平和低水平，見表1，利用design expert 7.0軟件中的 Plackett－Burman功能設計［10］并進行試驗。

表1 Plackett－Burman試驗設計各因子水平

最陡爬坡試驗設計 響應面擬合方程只有在考察的臨近區域里才能充分接近真實情況［13］，因此應該先逼近最大產酶區域后再建立有效的擬合方程。根據Plackett－Burman法篩選出的顯著因子效應大小設計它們的步長，進行最陡爬坡試驗，以尋找最大產酶區。其他因子選用Plackett－Burman試驗中1和－1水平的最大值或最小值。本試驗采用Plackett－Burman法的1/4步長進行設計。

響應面設計確定顯著影響因子的最佳值 以最陡爬坡的結果作為響應面試驗的中心點，利用軟件design expert 7.0 中的 Box－Behnken［12］設計功能得出試驗程序，進行試驗，記錄結果。利用Box－Behnken中的方差分析功能分析試驗結果，以確定顯著影響因子的最佳值。

3 結果與分析

3.1 Plackett－Burman設計篩選影響偶氮還原酶直接酶活的因子試驗結果

對Plackett－Burman的結果進行方差分析，以P值小于0.1為標準選擇3個顯著因子:pH、MgCl2、Na2HPO4，根據3個因子的效應大小分別確定pH=5、MgCl2為 1.5 g·L－1、Na2HPO4為 8 g·L－1，作為最陡爬坡試驗［11］的中心點，其他因子根據效應大小取最大值或最小值。

3.2 最陡爬坡試驗結果

采用Plackett－Burman法的1/4步長進行最陡爬坡試驗，試驗結果如表3所示。由表3可知，在6次試驗中，第2次試驗產生的偶氮還原酶酶活最高，故選其作為響應面試驗的中心點，即:MgCl2為1 g· L 、Na2HPO4為5 g·L 、pH值為6.0。

表2 Plackett－Burman試驗結果

表3 最陡爬坡試驗結果

3.3 響應面設計確定顯著影響因子的最佳值

采用Box－Behnken設計響應面試驗，其結果如表4所示。利用軟件design expert 7.0對試驗數據進行二次多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程為:Y(直接酶活)=2.09+0.028A+0.10B+0.51C－0.22A2－0.12B2－0.20C2－0.14AB+0.053AC+0.059BC，其中 A代表MgCl2，B代表Na2HPO4，C代表pH。

表4 Box－Behnken響應面試驗結果

對回歸方程進行方差分析，從響應面試驗方差分析結果(表5)可以看出:一次項C的影響非常顯著、B顯著;二次項 A2、C2的影響非常顯著、AB顯著，其余項的影響不顯著，故模型高度顯著(P=0.0010＜0.050);回歸模型的決定系數 R2=94.93%，表明其自變量與全體自變量之間的多元回歸關系顯著［14］;失擬項＞0.05，說明該回歸方程具有較好的擬合度［15］，試驗誤差小。因此，可以用該回歸方程對試驗結果進行擬合分析和預測。

表5 響應面試驗方差分析結果

由表6可知，試驗結果與預測相符，說明響應面分析法分析和預測偶氮還原酶直接酶活的值是可靠的。

表6 試驗結果的驗證

由圖1～圖6可以看出，Na2HPO4和MgCl2、pH和MgCl2、pH 和 Na2HPO4對 Escherichia coli CD－2產偶氮還原酶酶活的交互作用都是顯著的，這可以通過3個橢圓形的等高線圖和另外3個較陡的立體曲面圖清楚地看出來。從3個立體曲面圖還可以看出，A、B和C都存在極值點。

圖1 Na2HPO4和MgCl2交互作用對直接酶活影響的響應曲面圖

圖2 Na2HPO4和MgCl2交互作用對直接酶活影響的等高線圖

圖3 pH和MgCl2交互作用對直接酶活影響的響應曲面圖

根據回歸方程求一階偏導得到Y的極大值，即在 MgCl2為 0.99 g·L－1、Na2HPO4為 6.00 g·L－1、pH=6.5時直接酶活達到最大，模型所預測的極大值酶活達到 2.451 U·mL－1。在 MgCl2為 0.99 g·L－1、Na2HPO4為 6.00 g·L－1、pH=6.5 條件下做 3次平行試驗并取平均值，驗證試驗結果。由表6可知，試驗結果與預測相符，說明用響應面分析法分析和預測偶氮還原酶直接酶活的值是可靠的，從而確定了最佳培養基的組成為:甘露醇2 g·L－1、氯化銨3 g·L－1、接菌量 5%、pH=6.5、KH2PO42 g·L－1、Na2HPO46 g·L－1、MgCl20.99 g·L－1。優化后的酶活達到 2.429 U·mL－1，是初始酶活的2.85 倍。

圖4 pH和MgCl2交互作用對直接酶活影響的等高線圖

圖5 pH和Na2HPO4交互作用對直接酶活影響的響應曲面圖

圖6 pH和Na2HPO4交互作用對直接酶活影響的等高線圖

4 討論

E.coli CD－2是一株能夠降解偶氮染料、且在好氧條件下高效降解偶氮染料甲基紅的菌株。通過本次試驗，偶氮還原酶酶活提高的幅度較大。抑制酶活進一步提高的因子主要有空氣中的氧氣，它能將偶氮還原酶氧化。因此，可以在以后的試驗中探索在粗酶液中添加抗氧化劑，如利用β－巰基乙醇來提高酶活。偶氮還原酶是胞內酶，在一定條件下，每次能夠破碎細胞的數量一定。為了進一步提高破胞數量，從而提高酶活，有必要在以后的試驗中優化破胞方法，如增加破胞次數、提高輸出功率、將超聲波破胞和低溫反復凍融交替進行等方法。本試驗中，響應面優化后酶活達到2.429 U·mL－1，比優化前提高了2.85倍，證明響應面分析法優化得到的偶氮還原酶酶活培養基條件是有效的。最佳培養基組成:甘露醇 2 g·L－1、氯化銨 3 g·L－1、接菌量 5%、pH=6.5、KH2PO42 g·L－1、Na2HPO46 g·L－1、MgCl20.99 g·L－1。在最佳培養基條件下增強了 E.coli CD－2產偶氮還原酶的酶活，為今后應用于污水處理奠定了基礎。

［1］化工百科全書編輯委員會.化工百科全書(13)［M］.北京:化學工業出版社，1997.

［2］Zollinger H.Color chemistry:syntheses，properties andapplications of organic dyes pigments［M］.New York:Wile－VCH，2003.

［3］Robinson T，McMullan G，Marchant R，et al.Remediation of dyes in textile effluent:a critical review on current treatment technologies with a proposed alternative［J］.Bioresource Technology，2001，77(3):247－255.

［4］Padamavathy S，Sandhya S，Swaminathan K，et al.Comparison of decolorization of reactive azo dyes by microorganisms isolated from various sources［J］.Journal of Environmental Sciences，2003，15(3):628－632.

［5］Pinheiro H M，Touraud E，Tomas O.Aromatic amines from azo dye reduction:status review with emphasis on direct UV spectrophotometric detection in textile industry wastewaters［J］.Dyes Pigments，2004，61(2):121－139.

［6］Eichlerová I，Homolka L，Nerud F.Synthetic dye decolorization capacity of white rot fungus Dichomitus squalens［J］.Bioresource Technology，2005，97(16):2153－2159.

［7］彭躍蓮，韓燕劭，李建中，等.生物技術在印染和染料廢水處理中的應用［J］.環境科學進展，1997，5(3):56－64.

［8］安虎仁，錢易，顧夏聲.染料在好氧條件下的生物降解性能［J］.環境科學，1994，15(6):16－9.

［9］Franciscon E，Zille A，Fantinatti-Garboggini F，et al.Microaerophilic-aerobic sequential decolourization/biodegradation of textile azo dyes by a facultative Klebsiella sp.Strain VN－31［J］.Process Biochemistry，2009，44(4):446－452.

［10］He Yaoqing，Tan Tianwei.Use of response surfacemethodology to optimize culture medium for productionof lipase with Candida sp.99－125［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2006，43(1/4):9－14.

［11］熊智強，徐平，涂國全.利用響應面法優化紅谷霉素發酵培養基［J］.微生物學通報，2006，33(4):5－9.

［12］劉代新，寧喜斌，張繼倫.響應面分析法優化副溶血性弧菌生長條件［J］.微生物學通報，2008，35(2):306－310.

［13］歐宇，賈士儒，馬霞.細菌纖維素發酵培養基的優化［J］.食品與發酵工業，2002，29(1):18－22.

［14］楊冀艷，胡磊，許楊.Plackett－Burman設計和響應面法優化荷葉總黃酮的提取工藝［J］.食品科學，2009，30(6):29－33.

［15］楊實權，張喜成，劉軍鋒，等.響應面法優化釀酒酵母產油脂條件［J］.微生物學通報，2010，37(1):91－95.