響應面法優化豆粕發酵產共軛亞油酸條件

趙蓉蓉 桑衛國

(寧波大學海洋學院，寧波 315211)

近年來，一種被譽為“奇異天然營養素”的營養品在國外市場上流行起來，就是共軛亞油酸(Conjugated Linoleic Acid，CLA)。它是一系列含有共軛雙鍵，具有位置和幾何異構效應的亞油酸(LA)異構體總稱。最初是在反芻動物的肉和乳制品中發現的一種不飽和脂肪酸［1］。在自然界中，CLA存在于肉類、家禽、海鮮、奶酪、黃油、牛奶以及植物油等多種食物中，尤以反芻動物的乳制品中含量最豐富［2－3］。CLA以其獨特而多樣的生物活性作用而廣受大家關注。近些年研究發現，CLA具有減少脂肪累積和改變脂肪代謝，抑制腫瘤和動脈粥樣硬化的發生，增強機體免疫功能等功能，但其來源有限而動物不能自行合成［4－5］。CLA的制備方法主要有化學合成法和生物轉化法。化學合成法主要指亞油酸堿法異構化合成CLA，但合成的CLA異構體組成復雜，不利于產品的開發和利用。生物轉化法條件溫和，得到的CLA異構體組成單一，與天然食物中的CLA異構體組成相似。據報道，有來自14個屬的250多種細菌能將亞油酸轉化為共軛亞油酸，主要有腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等，以乳桿菌屬的植物乳桿菌研究最多，效果亦最優［6－11］。杜波［12］從玉米青貯中分離到一株能將亞油酸轉化成CLA的植物乳桿菌(ANCLA01)，在優化工藝條件下，每毫升發酵液中CLA含量達47.03 μg。梁新樂［13］自行分離篩選獲得一株植物乳桿菌HSC235菌株，具有轉化生成共軛亞油酸的能力。對HSC235菌株靜息細胞轉化亞油酸生成共軛亞油酸的反應條件進行了單試驗，獲得較佳反應條件參數，共軛亞油酸產量最高可達1.755 mg/mL。Lee等［9］對CLA微膠囊制備工藝進行了研究，提高了CLA的包含率及穩定性，為CLA的生產銷售提供便捷。豆粕經過微生物發酵，不僅常規營養得到改善，產生大量的菌體蛋白，使蛋白含量增加，而且其中的抗營養因子含量大大降低，微生物產生的各類消化酶類可有效地降解其中的抗營養因子和大分子營養物質，并富含多種生物活性因子，是一種優質的新型蛋白源［14］。目前，國內外已有不少研究表明，發酵豆粕可以適量替代水產動物飼料中的魚粉［15－16］。之前研究者大都集中于以亞油酸為底物，液體發酵生產CLA，而固態發酵豆粕生產CLA的報道甚少。因此，對以豆粕為培養基，植物乳桿菌為出發菌株，發酵生產CLA的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

植物乳桿菌突變株Lactobacillus plantarum Nb1:本實驗室分離保存。

1.2 培養基及試劑

蘿卜(品種:超級春白玉)，黃豆芽，食用調和油(52.5%LA):寧波大學農貿市場;豆粕:寧波金光食品有限公司;共軛亞油酸標準品(純度99.0%):sigma公司;其他試劑均為分析純。

培養乳酸菌的蔬菜汁制備:將蘿卜和豆芽打漿后，先用4層紗布過濾;濾液煮沸10 min，再次過濾后，即得澄清透明的蔬菜汁。將 V蘿卜汁:V豆芽汁=1∶5的比例配好，121℃，20 min滅菌，與豆粕等重混合作為發酵培養基。

1.3 CLA 分析測定

1.3.1 CLA 標準曲線的制作

準確稱取0.077 5 g共軛亞油酸標準品于50 mL容量瓶中，加正己烷溶解，定容。從中分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 50mL 容量瓶中，定容，配制成不同濃度的CLA溶液，在233 nm下測定各自吸光度。以橫坐標為CLA濃度，縱坐標為吸光度繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 CLA紫外吸收標準曲線

1.3.2 發酵豆粕中CLA產量的測定

豆粕發酵后取出65℃ 烘干，粉碎過篩，稱取2 g，加正己烷8 mL，水8 mL，振蕩，靜置10 min，萃取正己烷相轉入離心管中，離心(10 000×g，5 min)，加無水硫酸鈉干燥，取正己烷相1 mL，加正己烷6 mL稀釋，混勻，在紫外分光光度計中于233 nm下測定吸光度，空白對照為同條件發酵(不接種，其余條件相同)下豆粕的正己烷提取液，根據標準曲線測定 CLA含量。

1.4 單因素試驗

分別以菌種接種量、油脂添加量、發酵溫度、初始pH、發酵時間為變量，確定各個因素的適宜范圍。將新鮮豆粕90℃ 烘干，粉碎。取50 g豆粕裝入自封袋中，加50 mL混合蘿卜與豆芽汁，按單因素試驗對發酵條件進行優化，用磷酸鈉溶液調pH 4.5～7.0，油脂添加量為0～2.4 g，乳桿菌接種量為2%～7%(菌液濃度為1.5×105cfu/mL)，混勻，在不同溫度和不同時間下進行發酵。

1.5 響應面試驗設計

運用 Design－Expert 8.0.5軟件，根據 Box－Behnken中心組合試驗設計原理，采用3因素3水平的三元二次響應面分析方法，優化豆粕發酵條件。

1.6 數據處理

用Excel對數據進行處理，試驗結果計算標準差。采用Design－Expert 8.0.5軟件對響應面結果進行分析。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同菌種接種量對CLA產量的影響

菌種接種量對CLA產量的影響見圖2。由圖2可知，隨著菌種接種量的上升，CLA產量逐漸增大，在接種量為3%時達到最大，之后隨著接種量的增大CLA產量降低。研究表明，CLA是微生物對LA進行生物氫化作用的中間產物，加大接種量可增加初始酶量，對產量提高有利，但是生物氫化作用是一個需要能量的過程，而培養基的營養物質是一定的，菌種量的增加勢必會在一定程度上影響菌株的正常生長，進而影響了生物氫化酶的合成，致使CLA的產量下降［17－18］。

圖2 不同菌種接種量對CLA產量的影響(n=9)

2.1.2 不同油脂添加量對CLA產量的影響

油脂添加量對CLA產量的影響見圖3。由圖3可知，當油脂添加量極少時，CLA產量較低。CLA產量隨著油脂添加量的增大而增大。在油脂添加量為2 g·(50 g豆粕)－1時CLA產量達到最大，之后隨之降低。研究表明，發酵底物中亞油酸濃度過高會抑制乳酸菌株的生長，使其亞油酸異構酶的活性下降。亞油酸異構酶不足時難以將亞油酸完全轉化為CLA，進而使CLA的產量下降［19］。另外，植物乳桿菌生物轉化CLA時存在明顯的底物抑制現象，過高亞油酸濃度會抑制亞油酸異構酶活性［20］。梁新樂［13］研究表明，當亞油酸濃度小于0.08% 時，CLA產量隨亞油酸加入量的增大而增大，亞油酸濃度大于0.08%時，隨亞油酸濃度的增大，目的產物共軛亞油酸的產量反而會隨亞油酸濃度增大而減少，與本試驗研究結果相似。

圖3 油脂不同添加量對CLA產量的影響(n=9)

2.1.3 不同發酵溫度對CLA產量的影響

發酵溫度對CLA產量的影響見圖4。由圖4可知，當發酵溫度從29℃ 升高到37℃時，CLA產量逐漸增大，在37℃達到最大。溫度繼續上升時，CLA產量不再上升，而是呈現下降趨勢。微生物生長與溫度有著密切關系，低于或高于適合微生物生長的溫度都會影響微生物的生長，因此也會影響微生物的一些生理活動，比如產酶。酶的活性也需要在一定溫度的下有效，溫度過高或過低也會影響酶的活性，進而影響酶催化反應的進行。王武等［21］對嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶的酶學性質進行研究，結果表明隨著溫度升高，亞油酸異構酶的穩定性降低，當反應溫度超過40℃時，酶活力不斷減小，直到變性。因此，亞油酸異構酶在適宜的溫度下能夠較有效地催化LA轉變成CLA。

圖4 不同發酵溫度對CLA產量的影響(n=9)

2.1.4 不同培養基初始pH對CLA產量的影響

培養基初始pH對CLA產量的影響見圖5。由圖5可知，隨著pH的上升，CLA產量大幅上升，在初始pH 6.0時達到最大。培養基pH的不同會影響菌株的生長，同時pH還會影響酶的結構以致改變酶的活性。亞油酸異構酶在pH 2.0～8.8均具有活性，但僅在pH 5.5～8.5范圍時才具有轉化合成CLA的能力［22］。試驗所選用的植物乳桿菌的最適pH為6.0，在pH 6.0時植物乳桿菌細胞增殖較快。苗士達等［23］對亞油酸異構酶性質研究結果表明，在pH 6.0時，亞油酸異構酶活性較高，植物乳桿菌轉化亞油酸生成CLA量較大。于國萍等［24］對德式乳桿菌亞油酸異構酶酶學性質進行研究，結果表明當pH 6.0時，酶活力達到最高，在pH大于6.0的條件下酶活力迅速下降。本試驗最適初始pH 6.0，與前人研究結果一致。

圖5 不同培養基初始pH對CLA產量的影響(n=9)

2.1.5 不同發酵時間對CLA產量的影響

CLA產量隨發酵時間變化如圖6所示。接種培養后，每隔12 h取樣一次，測定CLA產量。在發酵12 h后即有CLA檢測到，之后隨著發酵時間的延長，CLA產量逐漸上升，在84 h時CLA產量達到最大。然后隨著時間的增加，發酵豆粕培養基中CLA產量呈現下降趨勢。研究表明，發酵時間過短，微生物產酶性能得不到充分發揮，發酵時間過長會導致細胞衰亡和培養基營養物質缺失，CLA的生物合成是一個動態的過程，生成的CLA是乳酸菌對LA進行生物氫化作用的中間產物，隨著反應的不斷進行，CLA會被繼續加氫轉化為油酸或硬脂酸［25］。因此，在一定的時期終止發酵更有利于CLA的積累。本試驗中，最適發酵溫度為84 h。

圖6 不同發酵時間對CLA產量的影響(n=9)

2.2 響應面分析試驗

在單因素試驗基礎上，采用Box－Behnken中心設計原理，對影響CLA產量的3個重要因素即菌種接種量、油脂添加量、發酵時間，采用響應面分析軟件設計了3因素3水平中心組合設計，對植物乳桿菌發酵豆粕產CLA的最佳發酵條件進行優化。其余條件為培養基初始pH 6.0，發酵溫度37℃。響應面試驗設計因素與水平表見表1，Box－Behnken試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗設計因素與水平表

表2 Box－Behnken試驗設計及結果

將試驗結果利用軟件Expert－design 8.0.5分析處理，得到回歸方程如下:

對以上回歸模型各項進行方差分析、F檢驗，結果見表3。

表3 回歸方程方差分析

由表3可知，模型的P值＜0.000 1，表明該試驗模型非常顯著。擬合項P值=0.386 6＞0.05，說明方程對試驗的擬合度良好，此方法可靠。在各模型參數中，X1、X2、X3、X2X3、X12、X22、X32對CLA產量影響極其顯著(P ＜ 0.01)，而 X1X2、X1X3對 CLA 產量影響不顯著。

圖7 接種量和油脂添加量交互作用的響應面及等高線

根據回歸分析結果做響應面圖及其等高線圖，見圖7～圖9所示。圖7～圖9顯示了菌種接種量、油脂添加量、發酵時間對發酵豆粕中CLA產量的影響及其他們之間的相互作用。由圖7～圖9可知，3個因素(X1、X2、X3)對發酵豆粕中CLA產量的響應值(Y)存在極值點。

根據軟件的響應面法分析得到一組植物乳桿菌發酵豆粕產CLA的優化結果:接種量3.18%，油脂添加量 1.93 g·(50 g 豆粕)－1，發酵時間 80.77 h，最大 CLA 產量為 702.11 μg/g。

為了實際應用的方便性，確定適宜的發酵條件為:接種量3.2%，油脂添加量為 1.93 g·(50 g豆粕)－1，發酵時間80 h，在以上條件下進行多次重復試驗，得到發酵豆粕中的平均CLA產量為700.32 μg/g，這與計算的數據較吻合，可見該模型能準確的預見實際產量。在上述條件下，所得CLA對食用油的轉化率為3.08%。

3 結論

以植物乳桿菌為出發菌株，豆粕為培養基，對固態發酵生產CLA進行了研究。單因素試驗考查了不同菌種接種量、油脂添加量、發酵溫度、培養基初始pH、發酵時間對CLA產量的影響。確定各自的最優值為:菌種接種量3.0%，油脂添加量2.0 g·(50 g豆粕)－1，初始 pH 6.0，發酵溫度 37 ℃，發酵時間84 h。

選取接種量、油脂添加量、發酵時間作為Box－Behnken試驗設計的變量，進行響應面分析，結果表明，3個因素對CLA產量的影響都極顯著，油脂添加量和發酵時間之間的交互作用也極顯著，接種量和油脂添加量以及接種量和發酵時間之間的交互作用不顯著。得到優化條件為:接種量3.2%，油脂添加量 1.93 g·(50 g 豆粕)－1，發酵時間 80 h。經重復試驗，得到發酵豆粕中的平均CLA產量為700.32 μg/g，CLA對食用油的轉化率為3.08%。實際結果與預測值較吻合。

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