ICR胎鼠成纖維細胞培養方法的優化

王 英，劉石磊，劉振偉，劉云海，倪和民，鄧桂馨，郭 勇

(北京農學院動物科學技術學院，北京 102206)

ICR胎鼠成纖維細胞培養方法的優化

王 英，劉石磊，劉振偉，劉云海，倪和民，鄧桂馨，郭 勇

(北京農學院動物科學技術學院，北京 102206)

目的 確定胎鼠成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)最優制備方法，為MEF的制備節省時間與原材料。方法 取胎鼠組織，采用組織塊培養法、胰酶消化培養法、胰酶消后組織塊培養法進行分離培養MEF，比較觀察MEF純度、生長速度、細胞形態等指標，篩選最節省時間與原料的一種培養方法。結果 組織塊培養法所得MEF生長速度慢，細胞體積小，雜細胞少，純化所需傳代次數少。胰酶消化培養法的MEF生長速度快，體積較大，雜細胞數量多，純化所需傳代次數較多。胰酶消化后組織塊培養法的消化后組織塊的成纖維細胞生長速度介于前兩種方法之間，細胞體積和形態與組織塊法培養結果相似，雜細胞數量較少，純化所需傳代次數少。結論 胰酶消化結合組織塊培養法能最大限度的利用材料，在短時間內可制備大量MEF，滿足核移植試驗與作為飼養層細胞的需求。因此，胰酶消化結合組織塊培養法是MEF最優培養方法。

ICR小鼠;胚胎成纖維細胞;培養

胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESC)是來源于早期胚胎內細胞團和原始生殖細胞的具有發育全能性的一類細胞［1－4］。誘導性多能干細胞(induced pluripotent cells，iPSC)是成熟的體細胞經誘導后又轉變為具有全能性的細胞［5－8］。ESC、iPSC體外增殖培養過程中首要解決的問題是抑制它們的分化。雖然在培養基中添加一些分化抑制因子能起到一定作用，但是效果不是很理想。成纖維細胞能夠分泌成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，a-FGF，b-FGF)等生長因子和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等細胞分化抑制因子，具有能夠改善接種細胞生長環境、促進接種細胞增殖同時抑制細胞分化的作用，已經成為培養ESC、iPSC的主要飼養層細胞。另外，自1996年多利羊誕生以來，體細胞克隆已經成為了科學界保護瀕危物種、保存優良種畜、產生轉基因動物等的主要方法［9］。而成纖維細胞借助取材方便、易于鋪層、容易生長等優勢成為體細胞克隆的首選供體細胞。常規成纖維細胞培養主要采用組織塊法與胰酶消化法。前者成纖維細胞原代生長所需時間較長;而后者生長出的原代細胞中雜細胞較多，需多次傳代才能得到純化的成纖維細胞。兩種培養成纖維細胞的常規方法均不能滿足短期內對飼養層細胞的大量需求;為此本實驗通過比較三種不同MEF的培養方法，從而確定一種MEF最優培養方法，進而能更快更好地為小鼠干細胞制備與核移植實驗提供大量的飼養層細胞與供體細胞。

1 實驗動物與試劑

1.1 動物

6～8周齡ICR小鼠購自維通利華公司(生產許可證號碼:SCXK－(京)2006－009)，自然光照環境培養。

1.2 試劑

DMEM培養基(Gibco公司)，胎牛血清(Sigma公司)，0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA(Sigma公司)，DPBS(Sigma公司)，二甲基亞砜(Sigma公司)。DMEM培養液1 L:13.4 g DMEM粉末，3.7 g NaHCO3，0.063 g 青霉素，0.10 g 鏈霉素，10% 胎牛血清。

2 實驗方法

2.1 ICR小鼠胚胎的獲得

將正常發情6～8周齡雌鼠與公鼠2∶1合籠，次日上午9∶00檢查陰栓，陽性雌鼠單獨飼養，并記為妊娠0.5 d。

2.2 MEF原代培養

在13.5 d時，將懷孕母鼠脫頸處死，用酒精擦拭腹部皮膚，無菌開腹，剪下子宮。于超凈臺中，用DPBS將子宮血洗凈后剪開子宮、胎膜，釋放出胎鼠，用 DPBS將胎鼠洗凈，去除胎鼠頭尾、四肢、內臟，將剩余部分組織用 DPBS洗凈后剪成肉泥狀。將組織分為兩份。

2.2.1 組織塊培養法:用胎牛血清潤濕60mm培養皿，將一份組織均勻分散在培養皿中(每個培養皿約接種一只胎鼠組織)。吸凈培養皿中多余血清后將接種組織的培養皿倒置放入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中約3 h。取出培養皿，每個培養皿加DMEM培養液3mL后，放入培養箱繼續培養。

2.2.2 胰酶消化法培養法:將剩余組織放入10mL玻璃離心管中，加入胰酶溶液，液面沒過組織塊，用吸管吹打混勻組織塊。將離心管放入培養箱靜置5 min，取出加入同胰酶等體積的DMEM培養液，用吸管混勻以終止消化，在培養箱繼續靜置5 min后，將上清轉入另一干凈的10mL玻璃離心管中。按照上述方法將組織消化3次，收集上清液。

將裝有上清的離心管以1 000 r/min離心10 min或1 500 r/min離心5 min，棄上清液。用DMEM培養液懸浮沉淀細胞后，將細胞接種于60mm培養皿中(每個培養皿約接種一只胎鼠消化下的細胞)，每個培養皿補培養液至 2mL，后放入 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱進行培養。

2.2.3 胰酶消化后組織塊培養法:將胰酶消化后剩余的組織塊用同2.2.1的方法移入培養皿進行培養。

2.3 MEF傳代培養

待細胞鋪滿培養皿底80%～90%時，進行傳代培養。將培養皿中培養液吸凈，用DPBS洗3遍，每個培養皿用250 μL胰酶消化約1～1.5 min，鏡下觀察細胞大部分變圓但沒有脫離培養皿底時，加1mL DMEM培養液終止消化。將細胞從皿底吹起(對于較大的組織塊，待同細胞一塊消化下后將其用鑷子除去)，然后按1∶2或1∶3進行傳代培養，接種密度為1.5×105個/mL。之后每2～3 d傳代1次。

2.4 MEF凍存與復蘇

細胞純化后，待細胞鋪滿培養皿底80%～90%時，進行細胞凍存。根據傳代方法進行消化，然后將含有細胞的培養液移入10mL離心管中，1 000 r/min離心10 min或1 500 r/min離心5 min，離心完后棄上清液。用單純的DMEM液重懸細胞，移入凍存管中，然后逐滴加入4℃預冷DMSO:FBS混合液(細胞凍存密度約為 1×106個/mL，DMSO∶FBS∶單純DMEM液 =1∶2∶7)。按以下程序凍存:4℃ (30～40)min，－20℃ (1.5～2)h，－80℃ 過夜，最后液氮中長期保存。復蘇時，從液氮中取出凍存的細胞迅速放入37℃水浴中，不斷搖晃凍存管使凍存液1～2 min之內融化，75%酒精消毒管外壁。離心去上清，用DMEM培養液重懸細胞，移入60mm培養皿中進行培養。

3 實驗結果

3.1 組織塊培養法

細胞生長速度最慢，20 d左右才有細胞從組織塊周圍爬出，約1個月才可傳代;長出的雜細胞最少，細胞體積較小，細胞形態幾乎均為典型的梭形，細胞彼此連接成片，整體上觀察如水流狀或放射狀(如圖1)。傳代2～3次可得到純化的成纖維細胞。

3.2 胰酶消化法培養法

細胞在2～3 h內即可貼壁生長，繁殖速度最快，如果細胞密度合適，2～3 d即可傳代1次;雜細胞數量最多;貼壁細胞密度小時，細胞體積較大，多為柵欄狀、有較大觸角等;細胞密度適宜時，細胞呈梭形;如果細胞密度過大，細胞則呈鵝卵石狀(如圖2)。傳代3～4次可得到純化的成纖維細胞。

3.3 胰酶消化后組織塊培養法

次日即有細胞從組織塊爬出生長，15 d左右即可傳代;雜細胞種類較少;細胞體積同單純的組織塊培養方法得到的細胞體積相似;細胞形態也多為典型的梭形，細胞連接成片，整體上看如水流狀或放射狀(如圖3)。傳代2～3次即可獲得純化的成纖維細胞(圖1～3見封底)。

4 討論

ICR小鼠是國際通用的價格比較低廉的一種封閉群小鼠，因其遺傳性能穩定、適應性強、繁殖能力強、實驗重復性好，目前被廣泛選為實驗用鼠。前人實驗證明，12.5 d～14.5 d［10－12］胎齡的小鼠適于制備MEF;但是12.5 d小鼠胚胎個體較小，不利于徹底去除頭、尾、四肢、內臟;14.5 d小鼠個體較大，骨骼肌開始發育，不利于組織的剪碎與細胞培養;13.5 d小鼠胚胎從胚胎體積、各組織發育程度等方面考慮都最適宜用于MEF培養。本實驗通過比較3種不同培養方法培養MEF，觀察比較MEF的生長速度、細胞形態、純化所需時間等來確定一種最快、最優質的培養MEF細胞的方法，為 ESC、iPSC與核移植試驗提供足夠的符合要求的飼養層細胞與供體細胞。

組織塊培養法只是用物理方法將皮膚制成組織塊，影響細胞生長的細胞間質不能被去除，因此，細胞的生長速度比較慢，接種20 d后，組織塊周圍才有細胞長出。同時，由于細胞間質對細胞生長的妨礙，大部分雜細胞會因為營養物質不充足和代謝產物不能及時排除而死亡，而成纖維細胞比較容易生長，不易受這些因素的影響，因此，組織塊法培養出的MEF雜細胞較少，傳代2～3次即可得到純化的MEF。

胰酶消化法是利用胰蛋白酶去除妨礙細胞生長的細胞間質如基質、纖維等，使細胞不聚集在一起，從而形成懸液，利于細胞從外界吸收養分和排除代謝產物。接種后細胞在幾小時內即可貼壁生長，由于胰蛋白酶的消化作用，使各類細胞都能更好地生長，所以雜細胞數量較多，傳代3～4次可將雜細胞去除。

胰酶消化后組織塊培養法是將消化后剩余的組織塊按組織塊培養法的操作培養 MEF。接種后24 h即有細胞從組織塊爬出生長，15 d即可傳代;雜細胞種類較少，傳代2～3次可得到純化的MEF。

鑒于上述培養結果，胰酶消化法結合消化后組織培養方法能在最短的時間內獲得最大量純化的MEF，并且能夠充分利用實驗材料，減少浪費、縮短培養周期。

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Optimization of the Culture Method of ICR Mouse Embryonic Fibroblasts

WANG Ying，LIU Shi-lei，LIU Zhen，LIU Yun-hai，NI He-min，DENG Gui-xin，GUO Yong
(College of Animal Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China)

Objective To investigate a most suitable method for harvesting mouse embryonic fibroblasts(MEF)).Methods Three different protocols including tissue only，cell-trypsin digestion，and tissue-trypsin digestion were applied for harvesting and culturing MEF.The MEF growth speed and cell morphology were also compared and analyzed respectively among the 3 methods.Results The cell proliferation was slow，cell size was small，but cells of other types were very few in the tissue only method，but the duration of purification was short.In the cell-trypsin digestion method，the cell proliferation was fast，cell size was somewhat large，but there were a little bit more cells of other types and the duration of purification was somehow longer.Finally，in the tissue-trypsin digestion method，the cell proliferation was very slow，cell size was very small，but there were also very few cells of other types.The duration of purification was very short.Conclusions Our findings indicate that the most efficient method for collecting and culturing mouse embryonic fibroblasts is the protocol of tissue-trypsin digestion.

ICR mouse;Embryonic fibroblast;Culture

R33

A

1671-7856(2012)08-0048-03

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.011

2012-05-07

圖1 組織塊培養法
Fig.1 Fibroblasts obtained by tissue piece culture method

圖2 胰酶消化法培養
Fig.2 Fibroblasts obtained by trypsin digestion method

圖3 胰酶消化后組織塊培養
Fig.3 Fibroblasts obtained by trypsin digestion-tissue piece culture method

國家自然基金面上資助項目(31072185，30871836)，家禽產業技術體系北京市創新團隊項目(2011，飼料營養功能)。

王英(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:動物產科及胚胎工程。E-mail:izbmyqdh@163.com。

郭勇(1963－)，男，教授，研究方向:畜禽生殖生理與動物生物技術。E-mail:y63guo@126.com.