實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在SPF雞四種垂直傳播疾病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

王 靜，陳冬妮，歐芷華，袁 文，鄧慶麗，陸勇軍，張 鈺

(1.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所(廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，廣州 510262;2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在SPF雞四種垂直傳播疾病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

王 靜1，陳冬妮2，歐芷華2，袁 文1，鄧慶麗2，陸勇軍2，張 鈺1

(1.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所(廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，廣州 510262;2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275)

目的 探討熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)SPF雞四種垂直傳播病毒的檢測(cè)應(yīng)用。方法 采集60份SPF雞及70份普通雞群蛋清、泄殖腔試子樣品，提取樣品核酸，分別進(jìn)行 ARV、REV、CAV、ALV四種病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線分析判讀樣品病毒拷貝數(shù)。結(jié)果 SPF雞 ALV 2份陽(yáng)性，檢出率3.3%，其余病毒檢測(cè)均為陰性;普通雞樣品REV檢測(cè)2份陽(yáng)性，檢出率2.9%，ALV 10份陽(yáng)性，檢出率14.3%。結(jié)論 熒光定量PCR檢測(cè)方法最低可檢測(cè)到100個(gè)拷貝核酸，檢測(cè)靈敏度較高，有望應(yīng)用于SPF雞臨床樣品的病原檢測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR;禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒;雞傳染性貧血病毒;禽白血病病毒;禽呼腸孤病毒;SPF雞

SPF雞及SPF雞胚是農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)學(xué)及生物制品研究、生產(chǎn)、檢驗(yàn)中不可缺少的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)材料，其質(zhì)量是否達(dá)標(biāo)，直接影響科研結(jié)果和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性以及生物制品產(chǎn)品質(zhì)量。2010年版《中國(guó)獸藥典》附錄《生產(chǎn)、檢驗(yàn)用動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)》明確要求，用于禽類制品毒種制備與鑒定、病毒活疫苗生產(chǎn)與檢驗(yàn)、滅活疫苗檢驗(yàn)的雞和雞胚應(yīng)符合國(guó)家無(wú)特定病原體(SPF級(jí))動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)［1］。近年來(lái)，我國(guó)獸用生物制品行業(yè)發(fā)展迅猛，企業(yè)在進(jìn)行疫苗外源病毒質(zhì)量控制的過(guò)程中對(duì)SPF雞(蛋)的量和質(zhì)會(huì)提出愈來(lái)愈高的要求，迫切需要加快我國(guó)SPF雞的微生物學(xué)監(jiān)測(cè)方法、試劑的研究。

網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生癥病毒(REV)、雞傳染性貧血病病毒(CAV)、和 J型禽白血病毒(ALV－J)、禽呼腸孤病毒(ARV)是養(yǎng)禽業(yè)中最常見(jiàn)的幾種垂直傳播的免疫抑制病毒，近年來(lái)國(guó)內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查多次報(bào)道這幾種病毒在我國(guó)養(yǎng)雞場(chǎng)中均普遍存在，且常出現(xiàn)多重感染［2－5］，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這些蛋傳性病毒除了會(huì)引起親代自身?xiàng)l件性持續(xù)性感染、免疫抑制、生產(chǎn)性能下降等危害之外，更嚴(yán)重的是能通過(guò)種蛋引發(fā)垂直感染，若是SPF種雞感染蛋傳性疾病，就會(huì)通過(guò)雞胚污染疫苗，更將會(huì)造成不可估量的嚴(yán)重后果，對(duì)于SPF雞生產(chǎn)企業(yè)來(lái)說(shuō)，也是首要排除的重點(diǎn)病原［6］。本研究中開(kāi)展對(duì) SPF雞(蛋)威脅最大的 ARV、REV、CAV、ALV 4種蛋傳性疾病病毒的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的研究，以及檢測(cè)技術(shù)在普通雞和SPF雞群中的應(yīng)用，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的分析，4種病毒的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)有望應(yīng)用于SPF雞病原檢測(cè)中。

1 材料和方法

1.1 樣本

廣東某SPF雞場(chǎng) SPF雞泄殖腔拭子 30份，蛋清樣品30份;廣東某普通養(yǎng)雞場(chǎng)普通雞泄殖腔拭子40份，蛋清樣品30份;其中 SPF雞、普通雞均未進(jìn)行4種病毒疫苗的免疫。

1.2 抗體檢測(cè)

采集 SPF雞及普通雞血清，分別進(jìn)行 CAV、ARV，REV、ALV血清抗體ELISA檢測(cè)，并進(jìn)行 SPF蛋清 ALV病毒 ELISA檢測(cè)，試劑盒均購(gòu)自 Idex公司。

1.3 核酸抽提

CAV、REV、ALV提取病毒 DNA，泄殖腔拭子用Omega公司E.Z.N.A stool DNA kit進(jìn)行提取，蛋清樣品用E.Z.N.A HP Viral DNA/RNA kit進(jìn)行提取，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ARV提取病毒RNA，泄殖腔拭子用 Invitrogen公司 Trizol進(jìn)行 RNA抽提，操作按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 cDNA制備

糞便及蛋清樣品提取病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系:5×primerScript buffer 2 μL，PrimerScript RT enzyme mixI 0.5 μL，oligo dT 25 pmol，random 6 mers 50 pmol，total RNA 6～7 μL，H2O up to 10 μL;反應(yīng)程序:37℃ 20 min，85℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)置 Takara 公司，PrimerScript RT reagent kit。

1.5 四種病毒SYBR green熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)合成

參照Genbank中登錄的相應(yīng)毒株序列 ARV 1133株s1基因(Gene ID:13310185);REV LTR片段序列(GI:57865344);ALV gag基因片段(GI:308053557);CAVvp2基因片段序列(GI:299474029)，通過(guò)軟件 Primer 5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

利用前述報(bào)道建立的四種病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.1 ARV熒光定量 PCR檢測(cè):標(biāo)準(zhǔn)品:取 pTARV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，以2.1×106到2.1×102copy 6個(gè)梯度稀釋度的質(zhì)粒作為定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。每一個(gè)梯度2個(gè)復(fù)孔;陰性對(duì)照3個(gè)復(fù)孔。樣品:SPF雞及普通雞糞便及蛋清cDNA。SYBG QPCR體系:ddH2O 9.5 μL，上下游引物(SYBR)各 0.4 μL，模板 cDNA 2 μL，SYBR green master mix 12.5 μL，總體系25 μL。冰上混勻，稍微離心。上機(jī)進(jìn)行 PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序:95℃ 10 min，1 cycle;95℃ 5 s，57.5℃ 10 s，72℃ 31 s，45 cycles;55℃～95℃ 讀取溶解曲線。QPCR試劑盒為Roche公司FastStart SYBR green master(ROX)，熒光定量PCR儀為ABI 7500。

1.6.2 REV熒光定量 PCR檢測(cè):標(biāo)準(zhǔn)品:取 pTREV質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，以5.2×106到5.2×102這6個(gè)梯度稀釋度的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR，每一個(gè)梯度采用2個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照3個(gè)復(fù)孔。樣品:SPF雞及普通雞糞便及蛋清樣品DNA進(jìn)行REV前病毒DNA的熒光定量PCR檢測(cè)。SYBG QPCR 體系:ddH2O 9.5 μL，上下游引物(SYBR)各0.4 μL，模 板 DNA 2 μL，SYBR green master mix12.5 μL，總體系 25 μL。冰上混勻，稍微離心。上機(jī)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序:95℃，10 min 1 cycle;95℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 31 s，45 cycle;55℃～95℃讀取溶解曲線。

1.6.3 ALV熒光定量 PCR檢測(cè):標(biāo)準(zhǔn)品:取 pTALV質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，以1.9×106到1.9×102這6個(gè)梯度稀釋度的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)梯度2復(fù)孔，陰性對(duì)照3個(gè)復(fù)孔。樣品:SPF雞及普通雞糞便及蛋清提取樣品DNA進(jìn)行ALV前病毒 DNA的熒光定量 PCR檢測(cè)。SYBG QPCR 體系:ddH2O 9.5 μL，上下游引物(SYBR)各0.4 μL，模 板 DNA 2 μL，SYBR green master mix 13.5 μL，總體系 25 μL。冰上混勻，稍微離心。上機(jī)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序:酶活化95℃，10 min;變性 95℃ 10 s，退火 50℃ 10 s，延伸 72℃ 31 s;50℃～95℃讀取溶解曲線。

1.6.4 CAV臨床樣品熒光定量PCR檢測(cè):標(biāo)準(zhǔn)品:取pT－CAV質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，以1.1×107到1.1×102這6個(gè)梯度稀釋度的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量PCR，每一個(gè)梯度采用2個(gè)復(fù)孔，設(shè)置陰性對(duì)照3個(gè)復(fù)孔。樣品:SPF雞及普通雞糞便及蛋清樣品DNA。SYBG QPCR 體系:ddH2O 9.5 μL，上下游引物(SYBR)各 0.4 μL，模板 DNA 或 cDNA 2 μL，SYBR green master mix 12.5 μL，總體系 25 μL。冰上混勻，稍微離心。上機(jī)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序:酶活化94℃，10 min;變性 94℃ 10 s，退火 59℃ 15 s，延伸72℃ 31 s;50℃～95℃讀取溶解曲線。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品定量做出標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合溶解曲線進(jìn)行樣品分析，樣品Ct值位于定量可信區(qū)間且Tm值與標(biāo)準(zhǔn)品一致的判為可疑，復(fù)檢確認(rèn)。Ct值大于定量標(biāo)準(zhǔn)品最低拷貝數(shù)Ct值以后的判為陰性，

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA檢測(cè)結(jié)果

40份 SPF 雞血清 CAV、REV、ARV、ALV－J抗體檢測(cè)均為陰性，30份SPF蛋清樣品ALV抗原檢測(cè)均為陰性;52份普通雞血清抗體檢測(cè)結(jié)果為:CAV陽(yáng)性率 82.7%(43/52)、REV 23.1%(12/40)、ARV 100%(52/52)、ALV－J 9.6%(5/52);30 份普通雞蛋ALV病原檢測(cè)陽(yáng)性率7%(2/30)。

2.2 ARV熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pT－ARV拷貝數(shù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1.1，1.3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線在 2.1× 106到 2.1×102拷貝范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)為r2為0.999，擴(kuò)增效率約為 103%，檢測(cè)下限為210個(gè)拷貝。30份SPF雞的泄殖腔拭子，30份蛋清液樣品Ct值均落于陰性區(qū)，拷貝數(shù)都＜2.1×102，溶解曲線分析也為陰性。(圖1.1，1.2)。普通雞的泄殖腔拭子和蛋清液樣品的Ct值均落于陰性區(qū)，拷貝數(shù)都 ＜2.1×102，溶解曲線分析也為陰性(圖1.3，1.4)。

圖1.1 SPF雞樣品ARV(SYBR)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:pT－ARV質(zhì)粒拷貝數(shù)依次2.1×106到2.1×101，樣品Ct值均落在陰性區(qū)間。Y=－3.23X+35.86，R2=0.999Fig.1.1 Quantitative real－time standard curve of pT－ARVplasmid and quantitative plot of SPF chicken samples.Serial dilutions of pT－ARV plasmid from 2.1×106to 2.1×101copies/μL were tested to generate a standard curve:y=－3.23X+35.86，R2=0.999.The Ct values of samples were all below the detection threshold

圖1.2 SPF雞樣品ARV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:pT－ARV的溶解曲線對(duì)應(yīng)單一溶解峰，Tm值在78.4℃;陰性對(duì)照對(duì)應(yīng)平緩的線條，樣品孔均為Tm值不同的溶解峰。Fig.1.2 Melting curve analysis of pT－ARV plasmid and SPF chicken samples.Tm of stanrdard pT－ARV plasmid was 78.4℃.The melting curves of SPF chicken samples exhibited nonspecific melting peaks.

圖1.3 普通雞樣品ARV(SYBR)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:pT－ARV質(zhì)粒拷貝數(shù)依次為2.1×106到 2.1× 102，y=－3.33X+36.92，R2=0.99，樣品Ct值均落在陰性區(qū)間。Fig.1.3 Quantitative real－time standard curve of pT－ARV plasmid and quantitative plot of common chicken samples.Serial dilutions of pT－ARV plasmid from 2.1×106to 2.1×102copies/μL were tested to generate a standard curve:y=－3.33X+36.92，R2=0.99.The Ct values of samples were all below the detection threshold.

圖1.4 普通雞樣品ARV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:pT－ARV標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)單一溶解峰，Tm值78.4℃;陰性對(duì)照對(duì)應(yīng)平緩的線條，部分樣品有非特異溶解峰。Fig.1.4 Melting curve analysis of pT－ARV plasmid and common chicken samples.Tm of stanrdard pT－ARV plasmid was 78.4℃.The fluorescence melting curves of common chicken samples showed non－specific melting peaks.

2.3 REV熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pT－REV拷貝數(shù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品分析(圖2.1、2.3、2.5)，標(biāo)準(zhǔn)曲線在5.2×106到5.2×102拷貝范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)為r2為0.993～0.995，擴(kuò)增效率約為97%～98%。檢測(cè)下限為520個(gè)拷貝。30份SPF雞的泄殖腔拭子，30份蛋清液樣品REV前病毒DNA拷貝數(shù)都低于檢測(cè)下限，部分樣品Ct值落在定量范圍內(nèi)，但溶解曲線分析為非特異擴(kuò)增。(圖2.1，2.2);40份普通雞的泄殖腔拭子和30份蛋清液樣品REV前病毒DNA拷貝數(shù)大部分都低于520拷貝，溶解曲線分析，樣品出現(xiàn)非特異溶解峰。排除Tm值及溶解曲線異常檢測(cè)孔，初步篩選出來(lái)的陽(yáng)性可疑樣品3份。3份可疑陽(yáng)性樣品再次實(shí)驗(yàn)確認(rèn)2份為陽(yáng)性(圖2.3～2.6)。

圖2.1 SPF樣品REV(SYBR)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:標(biāo)準(zhǔn)品pT－REV質(zhì)粒拷貝數(shù)依次5.2×106到 5.2×102，Y=－3.398X+35.983，R2=0.995.Fig.2.1 Quantitative real－time standard curve of pT－REV plasmid and quantitative plot of SPF chicken samples.Serial dilutions of pT－REV plasmid from 5.2×106to 5.2×102copies/μL were tested to generate a standard curve:Y=－3.398X+35.983，，R2=0.995.

圖2.2 SPF雞樣品REV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:pT－REV標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)單一溶解峰，Tm值79.6℃;樣品出現(xiàn)非特異溶解峰。排除Tm值及溶解曲線異常檢測(cè)孔，未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性孔。Fig.2.2 Melting curve analysis of pT－REV plasmid and SPF chicken samples.Tm of standard pT－REV plasmid was 79.6℃.The fluorescence melting curve of SPF chicken samples showed non－specific melting peaks.

圖2.3 普通雞樣品REV(SYBR)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:標(biāo)準(zhǔn)品pT－REV質(zhì)粒拷貝數(shù)依次5.2×106到5.2×102，部分樣品孔落在檢測(cè)區(qū)間。Fig.2.3 Quantitative real－time standard curve of pT－REV plasmid and quantitative plot of common chicken samples.Serial dilutions of pT－REV plasmid from 5.2×106to 5.2×102copies/μL were tested to generate a standard curve:Some samples＇Ct values were located within the detection range.

圖2.4 普通雞樣品REV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線對(duì)應(yīng)單一溶解峰，Tm集中在79.6℃;樣品出現(xiàn)非特異溶解峰。排除Tm值及溶解曲線異常檢測(cè)孔，初步篩選出來(lái)的陽(yáng)性可疑樣品3份。Fig.2.4 Melting curve analysis of pT－REV plasmid and common chicken samples.Tm of standard pT－REV plasmid was 79.6℃.Three samples displayed the same Tm peak with that of standard plasmid，and were regarded as suspicious samples.

圖2.5 普通雞REV可疑樣品再次熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)依次5.2×106到5.2×102，可疑結(jié)果仍有兩份樣品結(jié)果陽(yáng)性。Y=－3.36X+35.159，R2=0.993Fig.2.5 Confirmation by QPCR detection of suspicious samples.pT－ARV plasmids were serially diluted from 5.2×106to 5.2×102copies/μL to obtain quantitative standard curve:Y=－3.36X+35.159，R2=0.993.There were still 2 suspicious samples which showed positive results.

圖2.6 普通雞樣品REV可疑樣品再次熒光定量PCR溶解曲線圖:標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線對(duì)應(yīng)單一溶解峰，Tm集中在79.6℃;樣品有低拷貝特異峰和雜峰。Fig.2.6 The melting curves of suspicious samples tested by QPCR detection.Tm of standard pT－REV plasmid was 79.6℃，2 samples with the same melting curve of standard plasmid，and the others were non－sense noisy.

2.4 ALV熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pT－ALV拷貝數(shù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品分析(圖3.1、3.3、3.5)，標(biāo)準(zhǔn)曲線在 1.9×106到1.9×102拷貝范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)為 r2約為0.999，擴(kuò)增效率約為98%～102%。檢測(cè)下限為190個(gè)拷貝。30份SPF雞的泄殖腔拭子，30份蛋清液樣品中ALV前DNA拷貝數(shù)大部分都小于190，3份樣品Ct值落在定量范圍內(nèi)。溶解曲線分析其2份可疑樣品出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品一致的單一溶解峰，1份為非特異雜峰(圖3.1～3.2)。30份普通雞的泄殖腔拭子和40份蛋清液大部分樣品ALV前DNA拷貝數(shù)都小于190，大部分樣品Ct值均落于陰性區(qū)，14份樣品Ct值落在定量范圍內(nèi);大部分樣品出現(xiàn)非特異溶解峰，排除兩份Tm值不同樣品，12份可疑樣品出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品一致的單一溶解峰或出現(xiàn)雜峰(圖3.3，3.4)，17份可疑樣品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，12份可疑樣品出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品一致的單一溶解峰，拷貝數(shù)在 199～326之間，判為陽(yáng)性。(圖3.5，3.6)。

圖3.1 SPF雞樣品ALV(SYBR)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:質(zhì)粒拷貝數(shù)依次1.9×106到1.9×102。3份樣品Ct值落在定量范圍內(nèi)。Y=－3.3797X+36.9035，R2=0.999Fig.3.1 Quantitative real－time PCR standard curve of pT－ALV plasmid and quantitative plot of SPF chicken samples.Serial dilutions of pT－ALV plasmid from 1.9×106to 1.9×102copies/μL were tested to generate a standard curve:Y=－3.3797X+36.9035，R2=0.999.＇The Ct values of three samples were within the detected range.

圖3.2 SPF雞樣品ALV(SYBR)熒光定量PCR5份可疑樣品溶解曲線圖:標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線對(duì)應(yīng)單一溶解峰，Tm集中在82.1℃;2份可疑樣品孔出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品孔一致的單一溶解峰，1份出現(xiàn)雜峰。Fig.3.2 Melting curve analysis of pT－ALV plasmid and SPF chicken samples.Tm of standard pT－ALV plasmid was 82.1℃.Two samples displayed the same Tm peak with that of standard plasmid，were regarded as suspicious samples，and the others showed to be non－specific melting curves.

圖3.3 普通雞樣品ALV(SYBR)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:質(zhì)粒拷貝數(shù)依次7.6×106到7.6×101，14份樣品拷貝數(shù)大于檢測(cè)最低拷貝數(shù) 190。Y=－3.2649X+37.1308，R2=0.998。Fig.3.3 Quantitative real－time standard curve of pT－ALV plasmid and quantitative plot of common chicken samples.Serial dilutions of pT－ALV plasmid from 7.6×106to 7.6×101copies/μL were tested to generate a standard curve:Y=－3.2649X+37.1308，R2=0.998，and the Ct values of 14 samples were located within the detection range.

圖3.4 普通雞樣品ALV(SYBR)熒光定量PCR 14份可疑樣品溶解曲線圖:標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線對(duì)應(yīng)單一溶解峰，Tm集中在82.1℃;排除兩份Tm值不同樣品孔，12份可疑樣品出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品一致的單一溶解鋒或出現(xiàn)雜峰。Fig.3.4 Melting curve analysis of pT－ALV plasmid and common chicken samples.Tm of standard pT－ALV plasmid was 82.1℃.There were 12 suspicious samples showing the same Tm with that of standard plasmid except 2 non－specific melting curves.

圖3.5 SPF及普通雞ALV 17份可疑樣品DNA再次熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)依次7.6×106到7.6×102，4份樣品低于檢測(cè)最低拷貝數(shù)190。Y=－3.2803X+37.1187，R2=0.991。Fig.3.5 Confirmation by QPCR detection of suspicious samples.pT－ALV plasmids were serially diluted from 7.6×106to 7.6×102copies/μL to obtain quantitative standard curve:Y=－3.2803X+37.1187，R2=0.991.There were still 13 samples in the suspicious samples which showed positive results.

圖3.6 SPF及普通雞ALV 17份可疑樣品再次熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線對(duì)應(yīng)單一溶解峰，Tm集中在82.1℃;12份可疑樣品孔出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品孔一致的單一溶解峰。5份為非特異雜峰，排除。Fig.3.6 The melting curves of suspicious samples were tested by QPCR detection.Tm of standard pT－ALV plasmid was 82.1℃，12 samples with the same melting curves of standard plasmid，and the other 5 samples were non－specific melting curves.

2.5 CAV熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果及分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pT－CAV拷貝數(shù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品分析(圖3.1、3.3、3.5)，標(biāo)準(zhǔn)曲線在 1.1×107到1.1×102拷貝范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)為r2約為0.998～0.999之間，擴(kuò)增效率約為86%～94%。檢測(cè)下限為110個(gè)拷貝。30份SPF雞的泄殖腔拭子，30份蛋清液樣品的拷貝數(shù)小于檢測(cè)下限110，且溶解曲線分析均為無(wú)意義噪音或直線，CAV檢測(cè)均為陰性(圖4.1，4.2)。30份普通雞的泄殖腔拭子和30份普通雞蛋清液樣品的拷貝數(shù)都小于檢測(cè)下限110，且溶解曲線分析均為無(wú)意義噪音或直線，CAV檢測(cè)均為陰性(圖4.3，4.4)

2.6 ELISA檢測(cè)方法與qPCR檢測(cè)方法的比較

SPF雞的4種病毒抗體檢出率為0，說(shuō)明 SPF雞未感染4種病毒。然而，普通雞樣品都能檢出4種病毒抗體，檢出率分別是 ARV 100%，CAV 82.7%，REV 23.1%，ALV 9.6%，說(shuō)明普通雞已感染4種病毒。QPCR檢測(cè)病原方法，4種病毒在SPF雞中僅ALV檢2/60份陽(yáng)性，檢出率3.3%，其余病毒檢測(cè)均為陰性，而普通雞場(chǎng)樣品 REV檢測(cè)2/70份陽(yáng)性，檢出率 2.9%，ALV 10/70份陽(yáng)性，檢出率14.3%。

3 討論

3.1 ALV、CAV、REV、ARV 的感染特征

ALV是一群逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有多種亞型。其中A、B、C、D亞型主要在蛋雞引發(fā)淋巴樣腫瘤，J亞型主要在肉雞引發(fā)骨髓細(xì)胞瘤，但近年來(lái)在蛋雞中的發(fā)生率也在上升。各種年齡雞均可感染ALV發(fā)病，患病雞極度消瘦，生長(zhǎng)發(fā)育不良，免疫反應(yīng)低下，產(chǎn)蛋率下降，死亡率高。ALV感染前期雖不產(chǎn)生明顯可見(jiàn)腫瘤，但可誘發(fā)雞群的免疫抑制狀態(tài)，引起感染雞只消瘦，產(chǎn)蛋下降等問(wèn)題，還會(huì)導(dǎo)致不同程度的繼發(fā)感染。CAV感染特征是導(dǎo)致雛雞的全身淋巴組織萎縮和再生障礙性貧血，并伴隨免疫抑制，是一種既能垂直感染又能橫向感染的病毒，垂直感染的雛雞一般表現(xiàn)為急性臨床癥狀，水平傳播感染的雛雞表現(xiàn)為亞臨床癥狀，成年雞能感染CAV病毒，而且排毒，但不表現(xiàn)臨床癥狀，產(chǎn)蛋量、受精率、孵化率等均無(wú)明顯影響。ARV一些毒株可引發(fā)雛雞的病毒性關(guān)節(jié)炎，多數(shù)毒株可能只是表現(xiàn)消化道功能紊亂、羽毛生長(zhǎng)差，生長(zhǎng)緩慢等亞臨床癥狀，但可造成不同程度的免疫抑制，特別是垂直感染的雛雞，易導(dǎo)致并發(fā)或繼發(fā)其他疾病。REV是反轉(zhuǎn)錄病毒科病毒，感染后引起以網(wǎng)狀細(xì)胞增生為主要特征的綜合征。REV可水平傳播，也可垂直傳播。一般感染低日齡雞，特別是新孵出的雛雞及胚胎，感染后引起嚴(yán)重的免疫抑制或免疫耐受［6，7］。近年來(lái)REV、ALV、CAV、ARV這四種垂直傳播病原在種雞業(yè)中的發(fā)生率有上升的趨勢(shì)，這類病毒不僅能通過(guò)水平接觸傳播，而且還可通過(guò)種蛋垂直傳播而將疫情擴(kuò)大，感染雞群常常表現(xiàn)為亞臨床形式，并造成不同程度的免疫抑制，導(dǎo)致免疫失敗從而給生產(chǎn)帶來(lái)?yè)p失，而使用攜帶了病原的SPF雞胚生產(chǎn)的疫苗更有可能導(dǎo)致種雞接種后商品代的感染，危害被放大，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此及時(shí)檢出和淘汰病雞對(duì)控制這類疾病具有重大意義。

圖4.1 SPF雞樣品CAV(SYBR)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:質(zhì)粒拷貝數(shù)依次1.1×107到1.1×102，樣品Ct值均落在不可信區(qū)間，遠(yuǎn)低于最低拷貝數(shù)，判斷為陰性。Y=－3.70X+38.11，R2=0.998Fig.4.1 Quantitative real－time standard curve of pT－CAV plasmid and quantitative plot of SPF chicken samples.Serial dilutions of pT－CAV plasmid from 1.1×107to 1.1×102copies/μL were tested to generate a standard curve:Y=－3.70X+38.11，R2=0.998.The Ct value of samples were all below the detection threshold.

圖4.2 SPF雞樣品CAV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線對(duì)應(yīng)單一溶解峰，Tm集中在79.9℃附近;樣品孔均為無(wú)意義噪音或直線。Fig.4.2 Melting curve analysis of pT－CAV plasmid and SPF chicken samples.The Tm of standard pT－CAV plasmid was 79.9℃.The melting curves of all SPF chicken samples demonstrated as non－specific melting peaks.

圖4.3 普通雞樣品CAV(SYBR)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品定量圖:質(zhì)粒拷貝數(shù)依次1.1×106到1.1×102，樣品Ct值均落在陰性范圍。Y=－3.47X+35.59，R2=0.999。Fig.4.3 Quantitative real－time standard curve of pT－CAV plasmid and quantitative plot of common chicken samples.Serial dilutions of pT－CAV plasmid from 1.1×106to 1.1×102copies/μL were tested to generate a standard curve:Y=－3.47X+35.59，R2=0.999.The Ct values of samples were all below the detection threshold.

圖4.4 普通雞樣品CAV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線對(duì)應(yīng)單一溶解峰，Tm集中在80.3℃;樣品孔為低拷貝無(wú)意噪音或直線。Fig.4.4 Melting curve analysis of pT－CAV plasmid and common chicken samples.The Tm of standard pT－CAV plasmid was 80.3℃ .The melting curves of common chicken samples demonstrated as non－specific melting peaks.

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

既保持了 PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)，又克服了以往PCR技術(shù)中存在的假陽(yáng)性及不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)，近年來(lái)在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用方面發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、雞傳染性貧血病毒、禽白血病病毒、禽呼腸孤病毒這四種蛋傳性病毒引起的疫病在我國(guó)雞群中普遍存在，對(duì)于SPF雞及雞胚生產(chǎn)單位來(lái)說(shuō)尤其需要及早地準(zhǔn)確診斷才能避免病毒垂直傳播造成的進(jìn)一步擴(kuò)散污染。本文中所建立的四種雞蛋傳性病毒qPCR檢測(cè)方法，能夠檢測(cè)到最低100個(gè)拷貝的病原量，比普通PCR的檢測(cè)靈敏度提高了1個(gè)數(shù)量級(jí)，并首次將其應(yīng)用于SPF雞生產(chǎn)企業(yè)的疾病監(jiān)測(cè)。在臨床檢測(cè)應(yīng)用顯示 SPF雞 ARV、CAV和REV病毒均未檢出，ALV檢出率為2/60;普通雞群ARV和 CAV病毒未能檢出，REV檢出率為2/70，ALV檢出10/70，這些陽(yáng)性感染樣品的病毒拷貝數(shù)集中在100～500個(gè)之間，而且SPF雞群體的陽(yáng)性率及病毒拷貝數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普通雞群，說(shuō)明4種病毒的qPCR檢測(cè)方法能應(yīng)用于臨床樣品的病原檢測(cè)。

3.3 從ARV和CAV的血清抗體檢測(cè)

結(jié)果可以看出，普通雞群感染了該病毒并產(chǎn)生了廣泛的高抗體，這時(shí)可能存在病原的消失，應(yīng)用qPCR方法不能檢測(cè)到病原。REV、ALV感染雞在群體中只有部分產(chǎn)生抗體，qPCR方法檢測(cè)病原和ELISA方法檢測(cè)抗體均有陽(yáng)性結(jié)果，本研究中，ELISA抗體檢測(cè)SPF雞樣品結(jié)果均為陰性，而qPCR檢測(cè)方法檢出兩份 ALV陽(yáng)性，但是，我們建立的方法還不能有效區(qū)分內(nèi)源性和外源性ALV，病原檢出率明顯高于ELISA方法，因此，ALV－qPCR的檢測(cè)方法還需要進(jìn)一步優(yōu)化，同時(shí)擴(kuò)大檢測(cè)樣本量，與ELISA－Ab檢測(cè)方法的聯(lián)合使用進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.4 血清學(xué)抗體檢測(cè)

血清學(xué)抗體檢測(cè)能為動(dòng)物群體是否污染病原微生物提供依據(jù)，SPF雞是在屏障環(huán)境下隔離飼養(yǎng)、繁育的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體，血清抗體檢測(cè)背景較低，結(jié)果大多為陰性結(jié)果，臨床商品化ELISA檢測(cè)試劑應(yīng)用于SPF雞血清抗體檢測(cè)是否存在檢測(cè)靈敏度不夠的缺陷，對(duì)于生物制品原材料的 SPF雞胚來(lái)說(shuō)，SPF種蛋中攜帶病原的檢測(cè)尤為重要，因此僅僅采用血清學(xué)檢測(cè)方法來(lái)判斷SPF雞的微生物攜帶狀況是不夠的，應(yīng)采取定期棉拭子采樣、蛋清樣品檢測(cè)病毒核酸的方法來(lái)提高針對(duì)SPF雞攜帶病原微生物的檢測(cè)靈敏度。本研究中檢測(cè)到的陽(yáng)性樣本病毒核酸拷貝數(shù)在100到500個(gè)拷貝之間，說(shuō)明本檢測(cè)方法靈敏度較高，有望應(yīng)用于SPF雞臨床樣品的病原檢測(cè)。

［1］何海蓉，王正春，劉文峰，等.從獸用生物制品企業(yè)角度看我國(guó)SPF雞質(zhì)量控制現(xiàn)狀［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21(10，11):99－102.

［2］姜世金，孟姍姍，崔治中，等.我國(guó)自然發(fā)病雞群中MDV、REV和CAV共感染的檢測(cè)［J］.中國(guó)病毒學(xué)，2005，20(2):164－167.

［3］崔治中，孟姍姍，姜世金，等.我國(guó)白羽肉用型雞群中CAV、REV和REOV感染狀況的血清學(xué)調(diào)查［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37(2):152－157.

［4］康昭風(fēng)，謝金防，韋啟鵬，等.江西省主要養(yǎng)雞地區(qū)4種雞免疫抑制病的血清學(xué)調(diào)查［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22(11):125－127

［5］胡北俠，黃艷艷，路希山，等.肉種禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥、雞傳染性貧血和禽白血病血清學(xué)調(diào)查［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2009，34(1):25－27.

［6］吳萍萍.四種蛋傳性病毒病多重PCR檢測(cè)方法的建立［D］.碩士學(xué)位論文，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010:1－12.

［7］朱瑞良.種雞垂直傳播性疫病的危害及其控制［J］.獸醫(yī)導(dǎo)刊，2011，5:21－23.

Application of SYBR Green Fluorescent Quantitative Real-Time PCR in the Detection of Four Vertical Transmission Viruses in SPF Chickens

WANG Jing1，CHENG Dong－ni2，OU Zhi－h(huán)ua2，YUAN Wen1，DEN Qing－li2，LU Yong－jun2ZHANG Yu1
(1.Guangdong Laboratory Animal Monitoring Institute，Guangzhou 510620，China 2.School of Life Sciences，Sun Yat－sen University，Guangzhou 510275)

Objective To apply SYBR green I fluorescent quantitative real－time PCR(QPCR)in detecting 4 vertical transmission viruses of chicken and to evaluate its application value for the quality control of SPF chickens.Method Quantitative real－time PCR technique was used to detect REV，ALV，ARV and CAV RNA，DNA or provirus DNA in 30 cloacal swab samples and 30 eggs of SPF chicken samples as well as 40 cloacal swab samples and 30 eggs of common chicken samples.Standard curve and melting curve analyses were conducted to obtain the quantitative result.Results Out of the SPF chicken samples，2/30(3.3%)were ALV－positive，and the three other viruses were negative.For the common chicken samples，2/70(2.9%)were REV－positive，and 10/70(14.3%)were ALV－positive.Conclusions These QPCR assays show better sensitivity and specificity for detecting the 4 viruses in SPF chickens with a detection limit of 100 copies of target DNA per－reaction，and have a bright prospect in clinical application.

Quantitative real－time PCR(QPCR);Reticuloendotheliosis virus(REV);Chicken infectious anemia virus(CAV);Avian leukemia viruses(ALV);Avian reovirus(ARV);SPF chicken

R33

A

1671－7856(2012)08－0006－09

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.002

2012－06－10

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2008B090500205)，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2007B060101002)聯(lián)合資助。

王靜，女，助理研究員，研究方向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物遺傳、分子生物學(xué)研究。

張鈺，高級(jí)工程師。E－mail:zhangyugzh@hotmail.com。