不同品種實驗兔虹膜酪氨酸酶基因序列和表達量的變化

朱 亮，蔡月琴，屠 玨，陳民利

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053)

不同品種實驗兔虹膜酪氨酸酶基因序列和表達量的變化

朱 亮，蔡月琴，屠 玨，陳民利

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053)

目的 從酪氨酸酶基因序列和表達量兩個方面探討酪氨酸酶與家兔虹膜顏色表型的關系。方法通過PCR擴增和測序檢測4個具有不同顏色性狀的家兔品種的酪氨酸酶基因外顯子序列多態性;通過熒光定量PCR檢測酪氨酸酶基因表達水平。結果 白化品種日本大耳白兔和獺兔的TYR基因序列在第1118個堿基處都由C突變為A，并導致編碼蛋白在373位，即最后一個N－糖基化位點發生由Thr到Lys的突變。白毛黑眼兔和青紫蘭兔在第870個堿基處全部發生由A到T的無義突變。在白毛黑眼兔種群的所有個體和獺兔種群的部分個體中都發現TYR基因序列在第91個堿基處發生G到A的突變，導致氨基酸序列第31位處Val到Met的變異。經內參基因GAPDH的校正，TYR基因在白毛黑眼兔和青紫蘭兔中表達水平顯著高于在日本大耳白兔和獺兔中的表達水平(P＜0.01)。而在白毛黑眼兔和青紫蘭兔之間、日本大耳白兔和獺兔之間，TYR基因的表達差異沒有顯著性。結論 家兔TYR基因突變可能大幅度降低TYR基因表達，導致酪氨酸酶功能低下，從而影響虹膜顏色表型。

酪氨酸酶;虹膜;白毛黑眼兔;日本大耳白兔;獺兔;青紫蘭兔;

酪氨酸酶是黑色素產生過程中的關鍵酶。該蛋白主要在黑素細胞中表達，而黑素細胞主要分布在哺乳動物皮膚和眼睛的色素細胞層中。針對人類和小鼠的研究顯示，酪氨酸酶基因的突變可以導致眼皮膚白化病(oculocutaneous albinism，OCA)，累及眼部組織和皮膚組織［1］。

哺乳動物虹膜顏色一直被認為與色素細胞層中黑色素的分布數量和種類有關。酪氨酸酶是黑色素產生過程中的關鍵酶。黑色素生物合成過程大體可分為兩個階段，第一階段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羥化反應形成 L－3，4－二羥基丙氨酸(L－多巴)，并進一步將 L－多巴氧化生成多巴醌(DOPA quinon)。這兩步反應都是由酪氨酸酶催化的，酪氨酸酶在這里顯示了獨特的雙重催化功能。第二階段以多巴醌為原料從兩個不同途徑分別生成兩種不同類型的黑色素(真黑素和褐黑素)［2］。

哺乳動物的酪氨酸酶基因編碼序列全長1.6 Kb，包括5個外顯子。對于酪氨酸酶基因影響表型的方式目前存在不同的觀點。一些研究提示基因序列的突變導致了表型的變異。如針對人類和小鼠的研究顯示，酪氨酸酶基因的突變可以導致從完全白化到部分有色的一系列色素沉積相關性狀變化［3，4］。但 Nakamura 等［5］用酪氨酸酶基因內的微衛星標記來進行虹鱒魚的顯性白化病連鎖分析，結果顯示兩者無關聯，表明顯性白化病與酪氨酸酶基因的突變無關。而另一些研究者認為黑色素細胞里酪氨酸酶基因表達量與色素沉淀性狀有密切的關系。Commo等［6］研究發現 TYR在色素沉著性毛發中的基因表達量明顯高于非色素沉著性毛發中，并提出色素沉著性毛發的黑色素細胞里TYR基因表達量高的部分原因是由于酪氨酸酶活性增強。Pomerantz 與 Iwata 等［7，8］研究發現酪氨酸酶在黑種人皮膚中的活性高于在白種人皮膚中的活性。

日本大耳白兔是我國常見的實驗用兔，表型呈現出完全白化，被毛白色，虹膜無色素沉淀。白毛黑眼兔是來自日本大耳白兔種群的突變個體經十四年保種培育而建立的一個新實驗兔封閉群。因為其全身被毛白色而眼部虹膜為黑色，經鑒定命名其為日本大耳兔黑眼系，簡稱白毛黑眼兔。這兩種實驗兔遺傳背景接近，變異性狀明顯，是研究家兔虹膜顏色變異遺傳原理的良好材料。為了增加研究結果的說服力，本研究另外選取了獺兔和青紫蘭兔兩種具有極端相反虹膜顏色的家兔品種作為輔助證據。獺兔也是一種具白化表型的家兔，而青紫藍兔被毛藍灰色、耳尖及尾面黑色，眼圈、尾底及腹部白色，腹毛基部淡灰色，眼部虹膜為深藍色。

本研究選取以上4種不同虹膜顏色表型的家兔品種，從酪氨酸酶基因(TYR)序列、酪氨酸酶基因表達量這兩個方面探討酪氨酸酶與家兔虹膜顏色表型的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取:取家兔耳部皮膚，用酚氯仿法抽提DNA。DNA經過乙醇梯度沉淀后溶于TE緩沖液，－20℃儲藏備用。

1.2.2 RNA的提取和反轉錄:處死家兔后取眼部虹膜組織。立即使用 Takara(大連)的 RNAiso Plus提取試劑盒提取RNA。提取過程按照說明書操作。獲得的 RNA加入 DNase I(TaKaRa，大連)，37℃水浴20 min處理去除基因組DNA。取純化過的RNA 1 μL稀釋后用多功能酶標儀(Thermo)測定A260和A280值，確定其濃度和質量。

提取獲得的RNA立即進行反轉錄。反轉錄使用TaKaRa(大連)PrimeScrip反轉錄試劑盒。操作按試劑盒說明書進行。反轉錄獲得的cDNA置于4℃保存。

1.2.3 TYR基因編碼區的擴增:編碼序列的擴增分成兩部分進行:(1)從基因組 DNA中擴增一個0.95 kb的片段，其中包含 TYR基因第一外顯子。上游引物位于啟動子區域(5＇－TAGGACTTAGCC AAACATGTG－3＇;翻譯序列開始前第 85個核苷酸處)，下游引物位于第一內含子的5＇端 (5＇－TCTCACAGTCTATGTCCAGTAC－3＇;外顯子結束后的第7個核苷酸處);(2)其余的外顯子從cDNA中擴增，片段長度約1.0 kb。上游引物位于第一外顯子 3＇端(5＇－GAAATCCAGAAGCTGACAGG－3＇)，下游引物位于TYR翻譯終止子之后第77個核苷酸處(5＇－CATAGATACCAGTCTATTGGGC－3＇)。退火溫度55℃ (Bio－Rad PTC－200)。擴增產物送上海生工測序。

測序獲得序列使用DNAstar軟件包中的EditSeq軟件進行拼接，即獲得完整的TYR基因編碼區序列。使用 DNAstar軟件包中的 MegAlign軟件進行序列比對。

本研究參考的家兔野生型TYR基因序列來自于德國巨型兔(German giant)(Gen Bank序列號AF210660)，是 Bernhard 等［9］2000 年首先測序獲得的。

1.2.4 熒光定量PCR檢測:利用 Primer premier 5.0引物設計軟件，根據已知家兔酪氨酸酶基因序列(GenBank序列號 AF210660)設計引物。由TaKaRa(大連)工程有限公司合成。引物序列為(5＇－3＇): F－CAGCATCTTTCTTCTCCTCTTGG; RAGTCCTGGCTTTGTCATGGTTT。退火溫度55℃(Bio－Rad IQ5)。全部循環結束后作溶解曲線檢測引物質量。

1.2.5 標準曲線的建立:將cDNA模板10倍等比稀釋7次，將一共8個梯度濃度的樣品分別用TYR和GAPDH引物進行實時熒光檢測，每個稀釋樣品重復3次。將得到的CT值對初始模板量的log值做標準曲線。并計算R2值(可信度，顯示實驗數據的線性程度)。

通過對不同立體林下油用牡丹栽培模式的研究表明，油用牡丹-香椿套種模式牡丹的生長生理狀況最佳，定植第4年(林下套種3年)油用牡丹產籽量達191.36 kg/667m2，比油用牡丹單一種植模式增產51.97%，而油用牡丹-碧桃套種和油用牡丹-核桃套種模式則分別比油用牡丹單一種植模式減產58%和94%。因此，綜合立體栽培模式下油用牡丹的生長指標及產量表現，初步認為油用牡丹-香椿套種模式在河南地區具有較大推廣價值。

2 結果

2.1 TYR基因編碼序列多態性

各品種家兔TYR基因核苷酸序列多態位點如圖1所示。白化品種日本大耳白兔和獺兔的TYR基因序列在第1118個堿基處都由C突變為A，并導致編碼蛋白在373位，即最后一個N－糖基化位點發生由Thr到Lys的突變。該位點在所有參與檢測的實驗兔個體均表現為純合。

白毛黑眼兔和青紫蘭兔在第870個堿基處全部發生由A到T的無義突變。在12個白毛黑眼兔個體中有5個顯示雜合狀態，在12個青紫蘭兔個體中則有7個顯示雜合。在白毛黑眼兔種群的所有個體和獺兔種群的部分個體中都發現TYR基因序列在第91個堿基處發生G到A的突變，導致氨基酸序列第31位處Val到Met的變異。另外，多品種共享的編碼序列錯義突變在本研究檢測的個體中未出現。

2.2 TYR基因mRNA表達檢測結果

家兔目標基因TYR和內參基因GAPDH的溶解曲線見圖2，圖中的峰型單一且穩定，說明本研究使用的引物設計合理。

圖1 不同品種家兔TYR基因核苷酸多態位點測序圖a.第1118堿基位點;b.第870堿基位點;c.第91堿基位點Fig.1 The rabbit strains examined showing sequence variability.a.The 1118th neocleotide;b.The 870th neocleotide;c.The 91st neocleotide.

圖2 內參基因GAPDH(左)和目標基因TYR(右)的溶解曲線圖。Fig.2 Dissociation curve for TYR(left)and GAPDH gene(right).

對經等比稀釋的樣品進行熒光定量PCR，根據所獲CT值做圖，得到TYR和GAPDH兩對引物的標準曲線。其中TYR標準曲線斜率為3.375，R2值為0.998;GAPDH標準曲線斜率為 3.068，R2值為0.991。利用公式(E為擴增效率，P為標準曲線斜率)計算得到TYR和GAPDH兩對引物的擴增效率分別為97.8%和111.8%。

家兔TYR基因在不同家兔品種中的相對表達量見圖3。經內參基因GAPDH的校正，TYR基因在白毛黑眼兔和青紫蘭兔中表達水平及顯著高于在日本大耳白兔和獺兔中的表達水平(P＜0.01)。而在白毛黑眼兔和青紫蘭兔之間、日本大耳白兔和獺兔之間，TYR基因的表達水平差異沒有顯著性。

圖3 TYR基因在日本大耳白兔、獺兔、白毛黑眼兔和青紫蘭兔中的相對表達量。Fig.3 Relative expression level of TYR gene in Japanese White，Rex，WHBE and Chinchilla rabbits.

3 討論

3.1 TYR基因編碼序列多態性

迄今為止，文獻報道的TYR基因突變方式已達217種，包括錯義突變、無義突變、移碼突變、剪切位點突變等［10］。錯義突變主要集中于下列5個區域:銅離子結合位點(CuA和 CuB)，N末端至 CuA間，CuB至N末端疏水跨膜區域間，以及2個銅離子結合位點之間的區域。而無義突變、移碼突變等則相對隨機的分布于TYR基因的編碼區域各部分。不同的突變方式對同一基因功能的影響有所不同。一般認為，無義突變和移碼突變可導致特定的多肽產物缺乏和功能喪失，生物學效應明顯;而錯義突變能產生復雜的效應。因此，TYR基因的無義突變和移碼突變會導致酪氨酸酶無表達或低表達，繼而破壞黑色素的形成。而錯義突變影響酪氨酸酶的催化基團形成，酪氨酸酶可以形成但是功能缺失。

現有的實驗兔種群都是以封閉群形式飼養管理的。不同的毛色和眼色是實驗兔鑒定和分類的主要特征。酪氨酸酶作為色素生成的關鍵酶，編碼序列中多態性往往會造成的動物個體表型的差異，從而在選育過程中被誤認為種間差異而人為分開。因此，與行使其他功能的基因位點相比，酪氨酸酶在特定品種中總是顯示出較低的雜和度。

本研究檢測所得的品種特有序列突變位點都為純合型，而且編碼區沒有出現非品種特異性突變。這一現象再一次支持了TYR基因表達形式的假說，即TYR基因編碼區的錯義突變是以隱性形式行使功能的。

本研究檢測的兩個完全白化實驗兔品種(日本大耳白兔和獺兔)都出現了相同的突變(T373 K)，導致該基因編碼的酪氨酸酶的最后一個 N－糖基化位點發生了變異。有研究表明人類基因中同一位點的突變會導致 I型白化病［4］。由此推論，家兔酪氨酸酶基因第1118堿基位點的突變與家兔虹膜色素沉著表型相關。

白毛黑眼兔來自于日本大耳白兔種群中的突變個體，突變個體由白毛紅眼變成白毛黑眼。如果以德國巨兔為野生型對照的話，白毛黑眼兔在373氨基酸位點上發生了回復突變，同時表型也由虹膜色素缺失導致的紅眼回到了跟野生型個體相似的黑眼。這一現象提示我們，TYR基因1118堿基處由C到A的突變很可能會影響酪氨酸酶的功能，從而影響黑色素的合成和分布過程。而同時我們也觀察到，白毛黑眼兔在373氨基酸位點上發生變異后，虹膜組織產生了色素沉著，但并沒有改變動物個體的被毛顏色。以上現象提示毛色和虹膜顏色的基因控制可能是有部分重疊的兩條不同通路。白毛黑眼兔個體中另存在某些突變與色素形成過程的上游步驟相關，能夠影響皮膚黑色素的發生、轉移或者行使功能，但不影響虹膜組織。

3.2 TYR基因mRNA表達

目前，進行基因表達相對定量分析普遍采用的計算方法為2－ΔΔCt法，該方法利用目的組基因和對照組基因相對于內參基因的定量，獲得目的組基因相對于對照組基因的表達變化倍數。該方法因為其簡單、經濟、高通量而被廣泛用于相對定量研究。但是使用該方法有個前提條件，即目標基因和內參基因擴增效率都接近于100%且相互間效率偏差在5%以內。而實際研究中，受引物和樣本的限制，許多基因的擴增效率在反復調整后也無法達到100%。因此，本研究在定量分析中采用了 Pfaffl法［11］。該方法在 2－ΔΔCT法的基礎上做了修正，將目標基因和內參基因的擴增效率分別帶入計算，最終獲得目的組基因和對照組基因的表達變化倍數。用此方法得到的結果因為考慮了目標基因和內參基因的擴增效率差異，得到的結果比2－ΔΔCT法更精確。需要指出的是，利用 Pfaffl法對擴增效率的要求雖然沒有2－ΔΔCT法那么嚴格，但并非對擴增效率完全沒有限制，擴增方程的斜率要求在3.0～3.5之間為宜。R2值顯示實驗數據滿足衰減的線性程度，用來衡量重復樣品數據是否一致和不同拷貝數的初始模板是否具有相同的擴增效率。如果重復樣品的CT值明顯不同，R2值會變低。這時就應該優化反應條件，保證定量PCR反應的R2值 ＞0.980。

本研究目標基因和內參基因的引物擴增效率在經過調整后分別為97.8%和111.8%，標準曲線斜率分別為 3.07和 3.38，R2值分別為 0.991和0.998。以上數據結合溶解曲線說明:本研究中熒光定量檢測選用的引物和擴增條件理想，后續分析結果可靠。

酪氨酸酶作為黑色素生物合成過程中的限速酶，能夠催化黑色素生物合成過程中的前兩步反應，即催化酪氨酸羥化為左旋多巴和左旋多巴氧化為多巴醌的反應［2］。

由于酪氨酸酶的重要性，編碼酪氨酸酶的TYR基因也就成了研究黑色素性狀和虹膜顏色形成的候選基因之一。本研究發現TYR基因在虹膜呈深色的白毛黑眼兔和青紫蘭兔中的mRNA表達量是虹膜無色素沉積的實驗兔品種的3.54～4.31倍，差異顯著。

值得注意的是在本研究涉及的兩個完全白化家兔品種中，酪氨酸酶依然存在較低量的表達，與之相對應的現象是這兩個品種的家兔個體仍保有一定的視力，類似于人類眼部皮膚白化病1類型的B亞型(OCA1B)。結合序列分析的結果，參考OCA1B的遺傳機制［12］，可以推斷，在家兔中由于TYR基因突變導致TYR基因表達量大幅度降低，酪氨酸酶功能低下，從而導致虹膜顏色表型的相應改變。

綜上所述，本研究初步建立了家兔虹膜顏色性狀從酪氨酸酶外顯子DNA序列到mRNA表達量，最終影響虹膜顏色表型的粗略路線，根據實驗結果推斷T373K突變位點可能是決定家兔眼部虹膜組織色素沉淀的關鍵位點之一。家兔TYR基因表達量與虹膜顏色性狀有相關性。而對家兔酪氨酸酶的徹底認識需要針對更多品種家兔的進一步比較實驗。

哺乳動物酪氨酸酶的變化與肉眼直接可見的個體體表顏色性狀相關，針對家兔酪氨酸酶的遺傳和表達相關知識將有助于酪氨酸酶將來作為遺傳標記，用于以家兔為模型動物的轉基因和生物工程項目。

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Sequence and Expression of Tyrosinase Gene Variants in the Iris of Different Rabbit Strains

ZHU Liang，CAI Yue－qin，TU Jue，CHEN Min－li
(Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China)

Objective To compare the sequence and expression level of tyrosinase gene(TYR)among four rabbit strains covering a wide range in the extent of iris pigmentation and to verify the relationship between the tyrosinase gene and the iris colour of rabbits.Methods Exons of TYR were amplified and directly sequenced.The relative expression level of TYR in different strains of rabbits was analyzed by real－time quantitative PCR.Results The albino strains Japanese White and Rex rabbits showed a specific nucleotide exchange leading to an amino acid exchange(T373K)at the last N－glycosylation site.The silence nucleotide exchange(A→T)at nt870 of the tyrosinase coding sequence was observed in both the white hair black eyes(WHBE)and Chinchilla rabbits.A non－strain－specific amino acid exchange(V31M)was revealed in WHBE and Rex rabbits.The gene expression level of TYR in dark iris rabbits was significantly higher than that in non－pigmented ones.All results were corrected by the household gene GAPDH.Conclusions The nucleotide exchange at nt 1118(C→A)affect the function of tyrosinase，and the findings indicate that the gene expression level of TYR is related with the phenotype of iris color in rabbits.

Tyrosinase;Iris;WHBE rabbit;Japanese white rabbit;Chinchilla rabbit;Rex rabbit.

R33

A

1671－7856(2012)08－0001－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.001

2012－05－31

浙江省自然基金項目(Y3090548)。

朱亮(1978－)，女，副研究員，博士，研究方向:動物分子遺傳。E－mail:tozhuliang@126.com。