定眩顆粒質量標準研究

祁 紅，劉傳統

(湖南省石門縣人民醫院，湖南 常德 415300)

定眩顆粒由制何首烏、枸杞、當歸、白芍等11味中藥組方，具有滋養肝腎功效，對美尼爾氏綜合征等有較好療效。為控制制劑質量，確保臨床療效，筆者建立了制何首烏、白芍、枸杞子、當歸的薄層色譜鑒別方法，并采用高效液相色譜法對主要藥味當歸的主要成分阿魏酸和白芍的主要成分芍藥苷的含量進行測定，現報道如下。

1 儀器與試藥

島津LC－10AT型高效液相色譜儀，SPD－10Avp紫外檢測器，CLASS－VP色譜工作站;Meter AE240型電子天平。阿魏酸對照品(批號為110773－200611，供含量測定用)、芍藥苷對照品(批號為110736－200424，供含量測定用)、當歸對照藥材(批號為9271－200110，供鑒別用)、何首烏對照藥材(批號為0934－200106，供鑒別用)，枸杞子對照藥材(批號為1072－0301，供鑒別用)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;定眩顆粒(本院自制，批號分別為 100802，100815，100901);硅膠 G(青島海洋化工廠);甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別[1]

2.1.1 制何首烏

取本品1 g，加乙醚25 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取何首烏對照藥材0.2 g，加乙醚25 mL，同法制成對照藥材溶液。按處方要求制成缺制何首烏的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述3種溶液各5～10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，使成條狀，以三氯甲烷－甲醇(7∶3)為展開劑，展至約3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷－甲醇(20∶1)為展開劑，展至約7 cm，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液則無，見圖1 A。

2.1.2 白芍

取本品1 g，加乙醇50 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺白芍的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各5～10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇(4∶1)為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，在日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的主斑點，陰性對照品溶液則無，見圖1 B。

2.1.3 枸杞子

取本品6 g，加水50 mL，回流30 min，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取枸杞子對照藥材1 g，加水10 mL，同法制成對照藥材溶液。取缺枸杞子的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸(2∶3∶1)為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液則無，見圖1 C。

2.1.4 當歸

取本品1 g，加乙醚50 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取當歸對照藥材0.2 g，加乙醚10 mL，同法制成對照藥材溶液。取缺當歸的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯(17∶3)為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液則無，見圖1 D。

圖1 薄層色譜圖

2.2 阿魏酸含量測定[2]

2.2.1 色譜條件

色譜柱:大連依利特 Hypersil ODS2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈 －0.085 mol/L(17 ∶83);流速:1 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:316 nm;進樣量:10 μL。理論塔板數按阿魏酸計計算應不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

精密稱取阿魏酸對照品12.4 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL，置100 mL量瓶中制成每 1 mL 含 12.4 μg 的溶液，即得對照品溶液。精密稱取樣品 1.002 4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20mL，密塞，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失質量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

陰性干擾試驗:取缺當歸的陰性對照品，按供試品溶液制備方法制備，進樣，測定。結果表明，處方中其他藥味無干擾。色譜圖見圖2。

線性關系考察:分別精密吸取對照品溶液 3，5，10，12，15 μL，按上述色譜條件進樣測定，以對照品峰面積積分值(Y)為縱坐標、進樣量(X，μg)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y=547 536 3.936 X+5 479 803.335，r=0.999 98(n=5)。結果表明，阿魏酸進樣量在 0.037 ～ 0.186 μg 范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

圖2 阿魏酸高效液相色譜圖

精密度試驗:精密吸取對照品溶液10 μL，連續進樣5次，按上述色譜條件測定。結果阿魏酸峰面積積分值的平均值為681 630，RSD=0.19%(n=5)，表明方法精密度良好。

重復性試驗:取同一批樣品(批號為100802)6份，依法測定。結果阿魏酸平均含量為 0.236 mg/g，RSD=1.33%(n=6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，6，12，24 h時依法測定。結果峰面積積分值的 RSD=0.32%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(批號為100802)2 mL，精密加入一定量阿魏酸對照品，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測定，計算回收率。結果見表1。

表1 阿魏酸加樣回收試驗結果(n=6)

2.2.4 樣品含量測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀測定，以外標法計算含量。結果批號為100802，100815，100901的 3 批樣品中阿魏酸的含量分別為 0.236，0.245，0.267 mg/g。

2.3 芍藥苷含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱:大連依利特 Hypersil ODS2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈 －0.1%磷酸溶液(14∶86);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:232 nm;進樣量:10 μL。理論塔板數按芍藥苷計算應不低于2 000。

2.3.2 溶液制備

精密稱取芍藥苷對照品10.3 mg，置 200 mL 棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每 1 mL 含 51.5 μg的溶液，即得對照品溶液。精密稱取樣品0.8 g，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定質量，放置過夜，超聲處理40 min，放冷，稱定質量，用稀乙醇補足損失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3.3 方法學考察

陰性干擾試驗:取缺白芍的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備，進樣，測定。結果表明處方中其他藥味無干擾。見圖3。

圖3 芍藥苷高效液相色譜圖

線性關系考察:分別精密吸取對照品溶液 4，8，10，12，16 μL，按上述色譜條件進樣測定，以對照品峰面積積分值(Y)為縱坐標、進樣量(X，μg)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=1 301 751 X －11 971.65，r=0.999 8(n=5)。結果表明，芍藥苷進樣量在0.206～0.824 μg范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液10 μL，連續進樣5次，依法測定。結果芍藥苷峰面積積分值平均值為651 257，RSD=0.45%(n=5)，表明方法精密度良好。

重復性試驗:取同一批號樣品(100802)6份，依法測定。結果芍藥苷平均含量為 1.023 mg/g，RSD=1.07%(n=6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，6，8，12 h 時進樣(10 μL)，依法測定。結果峰面積積分值 RSD=0.87%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(批號為100802)6份，精密稱定，精密加入一定量芍藥苷對照品，按供試品溶液制備方法制備，依法測定，計算回收率。結果見表2。

表2 芍藥苷加樣回收試驗結果(n=6)

2.3.4 樣品含量測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀測定，以外標法計算含量。結果批號為100623，100701，100714的 3 批樣品中芍藥苷含量分別為 1.023，1.034，1.042 mg/g。

3 討論

阿魏酸的含量測定參考文獻[1]中方法，采用流動相乙腈－0.085%磷酸溶液(17∶83)或流動相乙腈－0.6 mol/L醋酸溶液(30∶70)，結果采用流動相乙腈－0.085%磷酸溶液(17∶83)時阿魏酸可以基線分離不受其他組分干擾，分離效果好，準確度高。芍藥苷的含量測定參考文獻[3]中方法，采用流動相甲醇－0.05 mol/L磷酸二氫鉀(30∶70)、流動相乙腈 －0.1%磷酸(14∶86)、流動相乙腈－0.2%磷酸(14∶86)，結果芍藥苷采用流動相乙腈－0.1%磷酸(15∶85)時可以基線分離不受其他組分干擾，分離效果好，準確度高。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:124，1 014，606，593.

[2]廉 蓮，賈天柱.回生第一丹質量標準的研究[J].中成藥，2008，30(12):220.