固體脂質納米粒作為水楊酸經皮給藥載體的研究

王愛萍 ，高大林 ，李 艷，戚元凱，慕宏杰，萬 芳

(1.煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005; 2.加卜吉中國品質管理中心，山東 青島 266200)

近年來，微載體透皮給藥研究取得了較大進展。固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticle，SLN)以生理相容性好、體內可降解、控釋和靶向作用明確、毒性低、適宜工業化生產和長期保存等特點而日益受到重視[1]。固體脂質納米粒用于經皮給藥具有獨特優勢[2－3]，如可通過穿透、水合和融合機制透皮轉運，較高的包封率和載藥量可保證藥物經皮滲透時有足夠的驅動力和透過量，以及具有封閉效應等。水楊酸臨床上主要用于治療皮膚淺部真菌病、脂溢性皮炎等，主要劑型為軟膏劑。將水楊酸制成固體脂質納米粒透皮給藥系統，旨在提高生物利用度，增加藥物在局部的儲量，并通過其緩釋特性獲得一定時間穩定的血藥濃度，從而提高治療效能和患者依從性。筆者制備了水楊酸固體脂質納米粒經皮給藥系統，考察固體脂質納米粒作為經皮給藥載體的促滲作用，并與普通軟膏比較，報道如下。

1 儀器與材料

RE－3000A型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);SK250HP型超聲清洗器(上海科導超聲儀器有限公司);UV－2550型紫外分光光度計(日本島津公司);Angilent 1100型高效液相色譜儀;ZTY智能透皮試驗儀(鞏義市英峪予華儀器廠);LD5－2A型低速離心機(北京醫用離心機廠)。水楊酸(北京益利精細化學品有限公司，批號為20070704);硬脂酸(天津市天大化工實驗廠，批號為20050117);豆磷脂(上海太偉藥業有限公司，批號為20070509);吐溫－80(國藥集團化學試劑有限公司，批號為F20060208);葡聚糖凝膠G－50(北京經科宏達生物技術有限公司，批號為17－0043－02)。Wistar大鼠，合格證號為 SCXK(魯)2009－0009，購于山東綠葉制藥有限公司。

2 方法與結果

2.1 水楊酸固體脂質納米粒的制備

采用薄膜超聲法制備。稱取水楊酸5 mg，硬脂酸20 mg，豆磷脂40 mg，置茄形瓶中，加10 mL氯仿超聲溶解，置旋轉蒸發儀上，減壓回收氯仿成膜，另取5 mL吐溫－80水溶液(1%)加至已成膜的茄形瓶中，旋轉，將膜洗下，超聲處理40 min，超聲后溶液于4℃保存，即得。

2.2 水楊酸含量測定方法

2.2.1 紫外分光光度法(水楊酸固體脂質納米粒體外評價)

紫外吸收波長確定:精密稱定水楊酸0.1 g，置量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，精密量取0.2 mL溶液，定容至10 mL，以甲醇為空白對照，于200～400 nm波長處紫外掃描。另按2.1項下方法制備空白及含藥固體脂質納米粒，量取0.2 mL，置10 mL量瓶，用甲醇溶解，以甲醇為空白，在200～400 nm波長處紫外掃譜。結果見圖1。可見在296 nm波長處，水楊酸有最大吸收峰，而空白固體脂質納米粒無吸收，故選定296 nm作為水楊酸的測定波長。

圖1 紫外掃描圖

線性關系考察:精密稱定水楊酸0.1 g，置100 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，得質量濃度為1 g/L的對照貯備液，精密吸取不同體積的上述溶液，分別用甲醇稀釋得質量濃度為8，12，16，20，24，28，32 μg/mL的系列溶液，于296 nm波長處測定吸光度(A)。以吸光度為縱坐標、質量濃度(C)為橫坐標繪制曲線，線性回歸方程為A=0.024 3 C+0.006 2，r=0.999 9(n=7)。結果表明，水楊酸質量濃度在8～32 μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗:取質量濃度為20 μg/mL的對照品溶液，平行測定6次。結果吸光度的 RSD為0.2%(n=6)。

重復性試驗:取同一批水楊酸固體脂體納米粒樣品(批號為20090507)5份各0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度并測定吸光度。結果平均吸光度為0.589，RSD為1.1%(n=5)，表明方法重現性良好。

穩定性試驗:取質量濃度為20 μg/mL的對照品溶液，于不同時間點(0，2，4，8，24 h)測定。結果吸光度的 RSD 為 0.7%(n=5)。

回收率試驗:精密量取空白固體脂體納米粒0.5 mL 3份，置10 mL量瓶中，分別精密加入質量濃度約為32 μg/mL的對照品溶液 4，6，8 mL，用甲醇稀釋至刻度，配成含水楊酸 12.8，19.2，25.6 μg/mL的樣品溶液，依法測定，計算回收率。結果平均加樣回收率為 101.4%(99.1% ～102.9%)，RSD=1.5%(n=3)。

2.2.2 高效液相色譜法(動物體內試驗樣品含量測定)

色譜條件與系統適用性試驗:色譜柱為ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇 － 0.2% 磷酸水溶液(55 ∶45)，流速為 1 mL/min，柱溫 25 ℃，檢測波長:230 nm，進樣體積 20 μL。色譜圖見圖1，水楊酸出峰處無雜質峰干擾，表明該法可用于水楊酸的含量測定。

線性關素考察:精密吸取2.2.1線性關系考察項下對照貯備液，分別用甲醇稀釋得質量濃度為 1，4，10，20，40，80，100 μg/mL的系列溶液，進樣測定，以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標繪制曲線并進行線性回歸，線性方程為 Y=55.406 X－0.743 2，r=0.999 9(n=7)。結果表明水楊酸質量濃度在 1～100 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:取質量濃度為10 μg/mL的對照品溶液，分別進樣6次。結果峰面積的 RSD為0.03%(n=6)。

重復性試驗:取同一水楊酸固體脂質納米粒透皮試驗樣品5份，依法測定。結果樣品中水楊酸平均質量濃度為15.02 μg/mL，RSD為1.0%(n=5)，表明方法重現性良好。

穩定性試驗:取質量濃度為10 μg/mL的對照品溶液，分別于0，2，4，8，24 h 時進樣分析。結果峰面積的 RSD 為 0.3%(n=5)。

回收率試驗:精密量取空白固體脂質納米粒0.5 mL 3份，置10 mL量瓶中，分別精密加入質量濃度約為100 μg/mL的對照品溶液 2，4，8 mL，用甲醇稀釋至刻度，配成含水楊酸 20，40，80 μg/mL的樣品溶液，依法測定。結果平均加樣回收率為100.9%(98.6% ～102.3%)，RSD=1.1%(n=3)。

2.3 水楊酸固體脂質納米粒包封率和粒徑測定

采用葡聚糖凝膠微柱法[4]測定包封率。取5 mL注射器兩支，去芯，分別加入4 mL葡聚糖凝膠制備微柱。分別精密量取0.2 mL水楊酸固體脂質納米粒和水楊酸溶液，置葡聚糖凝膠微柱頂部，靜置30 min后，以磷酸鹽緩沖液進行洗脫，洗脫液以甲醇破乳并定容至10 mL，于296 nm波長處測定其吸光度，繪制曲線見圖2。可見，洗脫體積至3 mL時，水楊酸可與水楊酸固體脂質納米粒良好分離。

取 5 mL注射器，按上述方法制備葡聚糖凝膠微柱，加水楊酸固體脂質納米粒0.2 mL后進行洗脫，收集洗脫液，甲醇破乳并定容;另精密量取水楊酸固體脂質納米粒，甲醇破乳并定容。分別于296 nm波長處測定兩者的吸光度，即 A1和 A2，計算包封率(%)=A1/A2×100%。

以電子顯微鏡觀察，制備的水楊酸固體脂質納米粒呈較均勻的球形，測定其載藥量為 3.87%，包封率為46.4%，平均粒徑為(380±35)nm。

圖2 不同體積洗脫液吸光度曲線圖

2.4 體外透皮試驗

大鼠乙醚麻醉后，用電動剃毛刀及剃須刀除去腹部毛，剝取腹部皮膚，除去皮下脂肪組織及黏連物，生理鹽水沖洗干凈，備用。將鼠皮固定在改良的Franz擴散池中間，角質層面向供給室。接受室中注入30%乙醇－生理鹽水作為接受液，使液面恰好與皮膚內層接觸。然后分別取水楊酸固體脂質納米粒混懸液及水楊酸軟膏，置皮膚表面，保持恒速攪拌和37℃的水浴恒溫，分別在1，2，4，6，8，10，12，24 h時間隔取樣2 mL，同時補充等體積釋放液。采用高效液相色譜法測定水楊酸含量，計算累積滲透量。釋藥孔直徑為1.3 cm，釋藥面積為 1.33 cm2，接受室體積為 17.5 mL。

取經透皮24 h后的大鼠皮膚，用生理鹽水將皮膚表面洗凈，以避免藥液對試驗結果的影響，沿有效透皮面積邊緣剪下有效透皮皮膚。將皮膚剪碎，勻漿機絞碎，渦旋3 min后4 000 r/min離心30 min，取上清液，用乙醚進行萃取，共萃取3次，萃取液氮氣吹干，甲醇溶解，離心后取上清液，采用高效液相色譜法測定殘余藥量。

水楊酸固體脂質納米粒及軟膏透過大鼠皮膚累積滲透量－時間動力學曲線圖見圖 3。可見，1)與軟膏劑相比，固體脂質納米粒顯著增強了水楊酸的經皮透過率(P ＜ 0.05)，增滲倍數為5.87，水楊酸固體脂質納米粒 24 h內累積透過量達 654.3 μg/cm2、透過率達34.8% ，而普通軟膏 24 h 內累積透過量僅為 128.0 μg/cm2、透過率僅為6.2%，表明固體脂質納米粒作為水楊酸經皮給藥載體可有效促進藥物的經皮吸收;2)水楊酸固體脂質納米粒無突釋現象，釋藥平穩，表明固體脂質納米粒作為經皮給藥載體有較好的緩釋作用，從而使藥物在較長時間內維持一定的有效濃度，可提高治療效能和患者依從性;3)24 h透皮試驗后，測定水楊酸固體脂質納米粒的皮膚殘余藥量為22.99 μg，而軟膏劑的皮膚殘余藥量僅為0.84 μg，說明固體脂質納米粒作為水楊酸的載體可明顯提高藥物在大鼠腹部皮膚中的貯留量，增加了局部藥物濃度，提高了皮膚靶向性，從而提高了藥物治療效能。

圖3 水楊酸固體脂質納米粒及軟膏劑經皮滲透累積滲透量－時間曲線

3 討論

本研究結果表明，與普通軟膏劑相比，固體脂質納米粒能顯著增強藥物的經皮透過率，并有明顯的緩釋效果，有效地提高了藥物的治療效能及患者用藥的依從性;同時，固體脂質納米粒還可增加藥物在皮膚中的局部濃度，有利于對局部炎癥和疼痛的治療。

經皮給藥系統常用的促滲方式為加入各種滲透促進劑。與促透劑作用機制不同，固體脂質納米粒主要通過穿透、水合和融合機制透皮轉運[5]。本研究結果表明，固體脂質納米粒不僅能促進水楊酸透皮吸收，而且還可增加藥物在局部的儲量，這可能與固體脂質納米粒經皮促滲機制有關。

常用的固體脂質納米粒包封率測定方法有超速離心法[6]、葡聚糖凝膠柱法和超濾法[7]。由于脂質納米粒的密度與水的密度非常接近，采用超速離心法時包封在納米粒內的藥物很難與游離藥物分離;而超濾法的儀器較貴且不能反復應用，一般不作首選。本試驗采用葡聚糖微柱離心法測定藥物的包封率，結果表明，該法準確方便、操作簡單，且重現性好。

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