沙利度胺對大鼠慢性移植物血管病的保護(hù)作用

徐自強(qiáng) 張巖 楊亦榮 夏鵬 吳琦

慢性排斥反應(yīng)是目前影響移植物長期存活的主要原因。治療慢性移植物血管病是延緩慢性排斥反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展的有效策略之一［1］，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。雖然國內(nèi)外均進(jìn)行了大量的研究，但對慢性排斥反應(yīng)及慢性移植物血管病的具體發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識沒有實(shí)質(zhì)性突破。其主要障礙之一是免疫、感染、炎癥、組織病理和生理等多種因素可以影響其病理發(fā)展［2］，而且這種病理變化現(xiàn)有的免疫抑制劑很難控制。最近的研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺有抗炎和抗血管生成的作用［3］，因此我們考慮其在治療慢性移植物血管病方面可能有一定的效果。本研究通過免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠移植血管組織上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和TNF-α，觀察沙利度胺對大鼠慢性移植物血管病的作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

近交系雄性 Brown-Norway(BN)大鼠，體質(zhì)量200～250 g，約8周齡;近交系雄性Lewis大鼠，約8周齡，體質(zhì)量200～250 g;均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。抗PCNA、TNF-α抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 大鼠腹主動(dòng)脈移植模型建立［4］

BN大鼠作為供體，腹腔內(nèi)注入1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，麻醉成功后取仰臥位，四肢固定，胸腹部脫毛，75%酒精、碘伏消毒，取腹部正中切口，暴露下腔靜脈和腹主動(dòng)脈，鈍性分離腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，上至左腎動(dòng)脈分支處，下至髂動(dòng)脈分支處，結(jié)扎腹主動(dòng)脈小分支及腰動(dòng)脈。于腎動(dòng)脈分支下、髂動(dòng)脈分支上解剖、斷離腹主動(dòng)脈1.0～1.5 cm，用肝素生理鹽水(100 mg/L)沖凈血管腔，修整血管外膜，并將其浸泡于保存液中置于4℃冰箱中保存。受體Lewis大鼠麻醉消毒后，取腹正中切口，暴露腹腔，借助顯微鏡剪開后腹膜，于腎動(dòng)脈分支下、髂動(dòng)脈分支上分離下腔靜脈和腹主動(dòng)脈，無創(chuàng)血管夾夾閉后，離斷腹主動(dòng)脈0.6～1.2 cm，用8-0血管縫合線將供鼠離體血管與受鼠腹主動(dòng)脈端端縫合。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

移植后32只Lewis大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組各8只:同種移植對照組(Lewis-Lewis)、異種移植對照組(BN-Lewis)、沙利度胺小劑量組(BNLewis)、沙利度胺大劑量組(BN-Lewis)。其中同種和異種移植對照組兩組以生理鹽水2 mL灌胃60 d，沙利度胺小、大劑量兩組術(shù)前1 d起分別予以沙利度胺50 mg·kg-1·d-1及100 mg·kg-1·d-1灌胃 60 d。術(shù)后60 d處死受鼠，取出移植動(dòng)脈，一部分留作光鏡標(biāo)本用于組織病理學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)法檢測，另一部分速凍于液氮中用于蛋白質(zhì)印跡法檢測。

1.4 移植動(dòng)脈組織病理學(xué)觀察

切取4組大鼠的移植動(dòng)脈，以肝素生理鹽水(0.1 mg/mL)沖洗血管腔。標(biāo)本用10%甲醛固定后石蠟包埋、切片，行HE染色。應(yīng)用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)(JD-801型，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)觀察移植動(dòng)脈的病理變化情況，通過光學(xué)顯微鏡放大200倍攝取圖像，輸入圖像分析系統(tǒng)內(nèi)。每個(gè)標(biāo)本在高倍視野下隨機(jī)取5個(gè)視野，測量移植動(dòng)脈內(nèi)膜的厚度，取平均值。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測移植動(dòng)脈組織PCNA、TNF-α表達(dá)

移植動(dòng)脈經(jīng)多聚甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片。二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，3%過氧化氫室溫20 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，復(fù)合消化液室溫孵育10 min，兔血清封閉20 min。甩干后依次滴加抗鼠PCNA單克隆抗體(1∶200稀釋)、抗鼠TNF-α單克隆抗體(1∶200稀釋)，4℃過夜，陰性對照以PBS代替。生物素標(biāo)記兔抗鼠IgG(1∶100稀釋，37℃孵育2 h)、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素(37℃孵育20 min)，每步驟之間均以PBS洗滌(5 min×3次)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后脫水封固鏡檢。每張切片在400倍光鏡下隨機(jī)采集5個(gè)不重疊視野，棕黃色為陽性染色區(qū)，采用圖像定量分析系統(tǒng)測量每個(gè)視野陽性染色區(qū)和光密度值，計(jì)算陽性相對面積(陽性染色區(qū)面積/每個(gè)視野面積)，取5個(gè)視野的平均值。陽性染色平均光密度=(陽性染色區(qū)面積/整個(gè)視野面積)×光密度值

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測移植動(dòng)脈組織PCNA、TNF-α蛋白表達(dá)

取4組大鼠的移植腹主動(dòng)脈，勻漿器充分研磨、勻漿，RIRA細(xì)胞裂解液裂解，在冰上放置30 min，于4℃、以離心半徑15 cm 12 000 r/min條件下離心15 min，棄沉淀，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度。30 μg蛋白上樣，12%SDS-PAGE電泳80 min，在4℃、250 mA電流條件下電轉(zhuǎn)1.5 h至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入 PCNA、TNF-α的一抗(1∶4000稀釋)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶100 000稀釋)，室溫孵育1.5 h，ECL試劑顯色并曝光成像，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照。將膠片掃描后，采用Quantity OneV6.42軟件分析各條帶灰度值，將各目的條帶灰度值與同一標(biāo)本內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白條帶灰度值的比值作為該目的蛋白的半定量結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，采用SPSS 11.5軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植動(dòng)脈組織病理學(xué)表現(xiàn)

同種移植對照組移植動(dòng)脈內(nèi)膜基本無增厚，內(nèi)膜細(xì)胞為單層，未見淋巴細(xì)胞浸潤，中膜和外膜無明顯改變(見圖1A)。異種移植對照組呈典型的移植物血管病表現(xiàn):可見內(nèi)膜環(huán)形增厚，大量成纖維細(xì)胞增生，內(nèi)膜內(nèi)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，中膜由4～6層彈力纖維和平滑肌構(gòu)成，內(nèi)彈力纖維有斷裂，在中膜與外膜之間有大量淋巴細(xì)胞浸潤，符合移植物血管病的病理改變(見圖1B)。沙利度胺小劑量組移植動(dòng)脈輕度增生，呈內(nèi)膜炎表現(xiàn)，內(nèi)膜下可見淋巴細(xì)胞浸潤，在中膜與外膜之間可見少量淋巴細(xì)胞浸潤(見圖1C)。沙利度胺大劑量組移植動(dòng)脈輕度增生，內(nèi)膜下可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，在中膜與外膜之間可見少量淋巴細(xì)胞浸潤(見圖1D)。4組移植動(dòng)脈內(nèi)膜厚度比較見表1。沙利度胺大劑量組血管內(nèi)膜厚度大于同種移植對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但沙利度胺大劑量組血管內(nèi)膜成纖維細(xì)胞較少，以炎癥細(xì)胞浸潤和內(nèi)皮細(xì)胞水腫為主。

注:A，同種移植對照組內(nèi)膜無增厚，為單層細(xì)胞;B，異種移植對照組內(nèi)膜明顯增厚，成纖維細(xì)胞增生;C，沙利度胺小劑量組內(nèi)膜輕度增生，呈內(nèi)膜炎表現(xiàn)，內(nèi)膜下可見淋巴細(xì)胞浸潤;D，沙利度胺大劑量組內(nèi)膜輕度增生，呈內(nèi)膜炎表現(xiàn)，內(nèi)膜下可見淋巴細(xì)胞浸潤

2.2 移植動(dòng)脈組織PCNA和TNF-α定性表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測移植動(dòng)脈中PCNA和TNF-α的表達(dá)情況見表1和圖2，3。PCNA在同種移植對照組很少表達(dá)，在異種移植對照組內(nèi)皮細(xì)胞及新生內(nèi)膜中強(qiáng)陽性表達(dá)，在沙利度胺小劑量、大劑量組內(nèi)皮細(xì)胞及新生內(nèi)膜中只有少量表達(dá);TNF-α在同種移植對照組幾乎無表達(dá)，在異種移植對照組內(nèi)皮細(xì)胞、新生內(nèi)膜強(qiáng)陽性表達(dá)，在沙利度胺小劑量、大劑量組內(nèi)皮細(xì)胞及新生內(nèi)膜中只有少量表達(dá)。沙利度胺小劑量、大劑量組移植動(dòng)脈內(nèi)膜PCNA和TNF-α表達(dá)較之異種移植對照組下降，較之同種移植對照組升高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05);移植動(dòng)脈內(nèi)膜PCNA和TNF-α表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 4組大鼠移植動(dòng)脈60 d后PCNA表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×200)

圖3 4組大鼠移植動(dòng)脈60 d后TNF-α表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×200)

2.3 移植動(dòng)脈組織PCNA和TNF-α定量表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示PCNA位于分子量36 kD蛋白帶，PCNA密度在異種移植對照組升高(P＜0.05);而沙利度胺小劑量及大劑量兩組PCNA蛋白表達(dá)低于異種移植對照組(P＜0.05)，仍高于同種移植對照組(P＜0.05)。TNF-α位于分子量17 kD蛋白帶，異種移植對照組TNF-α密度明顯升高，而沙利度胺小劑量組及沙利度胺大劑量組TNF-α蛋白表達(dá)低于異種移植對照組，仍高于同種移植對照組，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，見圖4和表1。

圖4 各組大鼠移植動(dòng)脈60 d后PCNA和TNF-α蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

3 討論

兩種MHC完全不匹配的近交系大鼠Lewis和BN大鼠之間的腹主動(dòng)脈移植模型是一種簡化的慢性移植物血管病模型［4］。該模型在移植后60 d時(shí)可表現(xiàn)出典型慢性移植物血管病，具有中層細(xì)胞壞死遷移、內(nèi)膜增生及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤3大特點(diǎn)，這些表現(xiàn)與人類移植物慢性血管病的病理改變類似［5］。

慢性移植物血管病是實(shí)體器官移植術(shù)后的主要遠(yuǎn)期并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為移植動(dòng)脈發(fā)生彌漫性、增生性改變。慢性移植物血管病是導(dǎo)致器官移植受者術(shù)后移植物失功的主要原因之一。慢性移植物血管病確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為各種致病因子通過免疫學(xué)途徑導(dǎo)致血管內(nèi)膜損傷，激活一系列細(xì)胞因子及生長因子(IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ等)。這些因子可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，激活動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，從而導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚、管腔阻塞，移植物因逐漸缺血而發(fā)生纖維化直至失功［6］。動(dòng)脈新生血管形成與內(nèi)膜內(nèi)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞浸潤及TNF-α等多種生長因子刺激相關(guān)［7］。TNF-α 主要由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，可刺激血管平滑肌細(xì)胞分泌血小板源性生長因子，后者可刺激平滑肌細(xì)胞增殖分裂。TNF-α還可促進(jìn)炎癥細(xì)胞、血小板等粘附至血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，促進(jìn)血栓的形成。TNF-α在慢性移植物腎病中表達(dá)上調(diào)，并且可促進(jìn)移植血管病變的發(fā)展［8］，因此移植物內(nèi)持續(xù)表達(dá)的TNF-α可作為移植物纖維化發(fā)展的臨床指標(biāo)之一。

移植物失功的主要原因是移植物血管病，其中心環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，造成其增生的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能與PCNA的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。PCNA僅在增殖細(xì)胞核內(nèi)合成和表達(dá)，在調(diào)控平滑肌細(xì)胞分裂增殖過程中起重要的作用，G1晚期開始增加，S期達(dá)高峰。其量的變化與DNA合成一致，因此PCNA可視為平滑肌細(xì)胞增殖的標(biāo)志，其在細(xì)胞分裂時(shí)協(xié)助DNA引導(dǎo)鏈和隨從鏈的合成，PNCA基因表達(dá)越強(qiáng)烈，說明平滑肌細(xì)胞的增殖越活躍［9］。檢測PCNA可以評價(jià)細(xì)胞的增殖狀態(tài)，同時(shí)，檢測PCNA的表達(dá)可以預(yù)測移植腎慢性排斥反應(yīng)的進(jìn)展［10］。本研究中TNF-α和PCNA在同種移植對照組幾乎無表達(dá)，在異種移植對照組內(nèi)皮細(xì)胞及新生內(nèi)膜中強(qiáng)陽性表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

表14 組大鼠移植動(dòng)脈內(nèi)膜厚度以及PCNA、TNF-α表達(dá)±s)

表14 組大鼠移植動(dòng)脈內(nèi)膜厚度以及PCNA、TNF-α表達(dá)±s)

注:與同種移植對照組比較aP＜0.05;與異種移植對照組比較 bP＜0.05。PCNA，上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原

images/BZ_107_233_2733_2242_2833.png同種移植對照組 8 1.70±0.29 5.79±0.76 23.32±3.81 0.21±0.020.53±0.08異種移植對照組 8 9.28±0.33 14.39±1.98a 93.72±13.60a 1.46±0.29a 1.78±0.21a沙利度胺小劑量組 8 3.60±0.32 9.87±1.14ab 55.76±6.33ab 0.88±0.13ab 1.20±0.19ab沙利度胺大劑量組 8 3.25±0.20a 10.13±1.08ab 48.25±6.49ab 0.85±0.12ab 1.13±0.14ab F值 1762.38 76.53 281.99 116.53234.33 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001＜0.001

沙利度胺(商品名反應(yīng)停)由瑞士Ciba公司于1954年合成，用于孕婦早孕反應(yīng)的鎮(zhèn)靜和止吐，20世紀(jì)60年代因致畸作用而撤出市場。后發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)作用，用于治療麻風(fēng)性結(jié)節(jié)性紅斑。1995年發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有抗血管生成作用，從而嘗試將其用于治療腫瘤性疾病。1999年，沙利度胺作為一種抗血管生成藥物被引入多發(fā)性骨髓瘤的治療并獲得空前成功。最近的研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺具有類似于甲潑尼龍的免疫抑制和抗炎作用，因此有中心在肺移植后早期應(yīng)用沙利度胺取代皮質(zhì)類固醇類藥物［11］。近10余年來，因沙利度胺對慢性移植物抗宿主病的療效已確立，還作為免疫抑制劑應(yīng)用于骨髓移植受者。動(dòng)物同種異體心臟移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沙利度胺具有抗排斥反應(yīng)作用，可明顯提高受者存活率［12］。盡管沙利度胺已在臨床應(yīng)用數(shù)年，但其確切作用機(jī)制尚未完全闡明。一般認(rèn)為其在抗血管生成及抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生方面具有較強(qiáng)的作用。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，異種移植對照組中移植動(dòng)脈呈典型的慢性移植物血管病表現(xiàn)，可見內(nèi)膜環(huán)形增厚，內(nèi)膜下少量淋巴細(xì)胞浸潤，中膜內(nèi)彈力纖維有斷裂，在中膜與外膜之間有大量淋巴細(xì)胞浸潤。而沙利度胺小劑量及大劑量組移植動(dòng)脈輕度增生或未見增生，內(nèi)膜下少量淋巴細(xì)胞浸潤，在中膜與外膜之間有少量淋巴細(xì)胞浸潤，呈內(nèi)膜炎表現(xiàn)。這提示沙利度胺可能具有抑制慢性移植物血管病發(fā)展的作用。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)沙利度胺可以顯著減少TNF-α和PCNA在移植動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及新生內(nèi)膜中的表達(dá)，這也提示沙利度胺抑制慢性移植物血管病的發(fā)生、減輕慢性排斥反應(yīng)的作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞因子及生長因子的產(chǎn)生有關(guān)，如減少TNF-α對血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激，進(jìn)而抑制動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，減輕移植物血管病變。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩個(gè)沙利度胺劑量組間未見明顯差異，提示在達(dá)到一定治療劑量后沙利度胺提取物對控制移植物血管病的效果可能與用藥量無相關(guān)性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過大鼠腹主動(dòng)脈移植模型提示，沙利度胺可能有延緩慢性移植物血管病的發(fā)生，減輕慢性排斥反應(yīng)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)移植物TNF-α和PCNA的表達(dá)，從而抑制動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移有關(guān)。

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