索氏提取-HPLC-ELSD法檢測銀杏葉片中萜類內酯的含量

高翠華，姜 恒

（遼寧石油化工大學 化學與材料科學學院，遼寧 撫順 113001）

分析測試

索氏提取-HPLC-ELSD法檢測銀杏葉片中萜類內酯的含量

高翠華，姜 恒

（遼寧石油化工大學 化學與材料科學學院，遼寧 撫順 113001）

建立一種基于索氏提取的綠色樣品前處理技術，采用HPLC-ELSD法測定銀杏葉片中總萜類內酯的含量。結果表明，銀杏內酯A、B、C和白果內酯均有良好的線性范圍，回收率均大于98%，檢測量在52～108 ng之間，且方法具有較好的精密度、穩定性和重復性。輔料無干擾。本方法可有效用于銀杏葉片中萜類內酯的提取與測定。

銀杏葉片；萜類內酯；索氏提取-HPLC-ELSD法

銀杏葉片系2005年藥典收錄的中藥品種[1]，是由銀杏葉提取物經加工制成的制劑，用于治療心腦血管疾病及多種復雜性疾病，效果顯著。萜類內酯是銀杏葉片的主要成分之一，主要包括銀杏內酯A（C20H24O9）、B（C20H24O10）、C（C20H24O11）和白果內酯(C15H18O8)[2,3]

銀杏葉片中萜類內酯的含量極低，目前提取方法主要有三種：溶劑萃取法，溶劑萃取-柱層析法和超臨界流體萃取法[4,5]，其中以溶劑萃取法應用最廣泛，弊端是該方法需要采用大量的極性或中等極性的有機溶劑，嚴重污染環境。本次樣品前處理方法采用索氏提萃取代替傳統的液液萃取，采用加熱的方式冷凝回流，減少有機溶劑使用量，保護環境。關于萜類內酯的含量測定方法主要有 TLC法，HPLC－UV法， HPLC－RI法， GC－MS法和HPLC-ELSD法等，其中HPLC-ELSD法是比較理想的一種方法[6,7]。本實驗亦采用 HPLC-ELSD法，使用外標兩點法對數方程分別計算白果內酯、銀杏葉內酯A、銀杏葉內酯B和銀杏葉內酯C的含量，四種銀杏內酯的含量之和即為總萜類內酯含量。

1 主要儀器與試劑

日本島津 LC-10ATvp高效液相色譜儀，奧泰2000 ELSD檢測器；甲醇，四氫呋喃和正丙醇均為色譜純(國藥集團有限公司)，乙酸乙酯為分析純(國藥集團有限公司)，水為重蒸餾水；銀杏內酯A、B、C和白果內酯均購于中國藥品生物制品檢定所；銀杏葉片由北京阜康仁公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性實驗

色譜柱：C18柱，4.6 mm×250 mm，5μm（迪馬公司, 鉆石系列）；流動相：正丙醇-四氫呋喃－水（1∶35∶64）； 流速：1.0 mL/min；ELSD檢測器，漂移管溫度99.5 ℃，載氣流速2.58 L/min；理論板數按白果內酯峰計算應不低于2 500,銀杏內酯A與銀杏內酯C峰的分離度應大于1.5。

2.2 色譜峰定位溶液的制備

取白果內酯，銀杏內酯A，銀杏內酯B和銀杏內酯C對照品各約1 mg,分別加適量甲醇制成對照溶液，即得。

2.3 對照品溶液及供試品溶液的制備

分別精密稱取白果內酯對照品，銀杏內酯A對照品，銀杏內酯B對照品，銀杏內酯C對照品各約10, 5, 5, 5 mg，加甲醇制成每1 mL各2, 1, 1, 1 mg的混合溶液，即得對照品溶液。

取銀杏葉片粉碎研細后粉末約5 g，精密稱定，用定性濾紙包好，置索氏提取器中，加入20 mL乙酸乙酯和2%鹽酸2滴，置80 ℃冷凝回流20 min，冷卻，取出，回收醋酸乙酯至干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照試驗

按工藝制備不含銀杏提取物的陰性樣品，照上述供試品溶液的制備方法制備成陰性對照品溶液，即得。分別精密吸取色譜峰定位溶液、對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖1和圖2。及塔板數符合規定，色譜峰從左到右依次是銀杏內酯C、銀杏內酯A、白果內酯和銀杏內酯B,輔料無干擾。

圖1 銀杏葉片中萜類內酯的對照品圖譜Fig.1 The chromatography of terpens lactones in standard solution

2.5 線形關系和線性范圍的考察

取白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B和銀杏內酯C對照品各約10, 5, 5, 5 mg，精密稱定，置同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別精密吸取適量，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進樣量的對數為橫坐標，峰面積的對數為縱坐標，繪制回歸曲線， 試驗結果表明：銀杏內酯C在7.968 μg～27.888 μg范圍內，銀杏內酯 A在 8.272～28.952 μg范圍內, 白果內酯在16.4～57.4 μg范圍內，銀杏內酯B在9.376～32.816 μg范圍內，進樣量的對數與峰面積的對數間均有良好的線性關系。

2.6 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液20 μL，連續進樣5次，記錄色譜圖，測定試驗精密度，結果表明，連續5次進樣，峰面積的RSD%均＜2.0%，說明本方法精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取銀杏葉片樣品，按上述供試品溶液的制備方法制備成供試品溶液，分別在0，2，4，6，8 h進樣20 μL，記錄色譜圖，結果表明，RSD%分別為0.43%，0.86%，1.52%和0.65，說明本方法穩定性良好。

2.8 重復性考察

取同一批銀杏葉片樣品6份，按上述含量測定項下的方法測定含量，結果RSD%分別為1.06%，0.58%，1.41%和0.32，說明本方法重復性良好。

2.9 回收率試驗

采用加樣回收法測定。取已知含量的銀杏葉片樣品粉碎研細后粉末約2.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，再分別精密加入適量的銀杏內酯C,銀杏內酯A,白果內酯和銀杏內酯B的對照品 （各約相當于2.5 g供試品所含的量）,依上法測定，計算回收率，結果見表1。實驗結果表明：銀杏內酯A, B, C和白果內酯的回收率分別為 98.76%，99.19%，99.83%和98.39%，即本法具有良好的回收率。

2.10 最低檢出量

取重復性項下樣品溶液1 mL，用甲醇溶液逐步稀釋定，分別得到銀杏內酯C，銀杏內酯A，銀杏內酯B和白果內酯的最小檢出量分別為52.2, 147.8, 64.0, 73.4 ng.

2.11 銀杏葉片含量測定

按照以上方法制備供試品溶液，測定3批中試樣品（阜康仁制藥公司提供）中萜類內酯的含量，每批樣品測定兩次，見表2。結果表明3批樣品含量均＞ 2.4 mg/片，結合2005年版藥典，含量符合規定[1]。

表1 銀杏葉片中萜類內酯的回收率測定結果Table 1 The recovery results of terpens lactones in ginkgo leaves tablets

表2 銀杏葉片中萜類內酯的含量測定結果Table 2 The concentration levels of terpens lactones in ginkgo leaves tablets

3 討 論

3.1 檢測方法的選擇

關于萜類內酯的含量測定方法主要有TLC法，HPLC－UV法，HPLC－RI法和GC－MS法等。TLC法受環境和操作影響大，重現性差；而 GC-MS法需衍生化，操作復雜。HPLC法若采用普通紫外檢測器，由于銀杏內酯屬末端吸收，測定干擾大。示差折光檢測器（RI），為通用型檢測器，但其對溫度等外界因素響應過于靈敏，重現性和檢測靈敏度差。ELSD為質量型通用檢測器，能克服以上缺陷，近年來應用日趨廣泛，故本品含量測定采用 HPLCELSD法。本文敘述了用HPLC-ELSD檢測銀杏內酯的含量，試驗證明本方法重復性好，專屬性強，靈敏度高，可準確的測定出銀杏內酯A、B、C和白果內酯的含量，從而有效的控制樣品的質量。采用ELSD檢測器測定銀杏內酯時,其峰面積值與樣品進樣量的線性關系不太理想,而將峰面積與樣品進樣量分別取對數后可得到理想的線性關系（這種現象與ELSD檢測器的檢測機理是一致的[9][10]），故本品含量測定采用外標兩點法對數方程計算。

3.2 樣品前處理方法的選擇

本次實驗采用乙酸乙酯索氏提取20 min。結果表明，2%鹽酸和80 ℃高溫作用下，萜類內酯在乙酸乙酯中溶解性良好，本方法重復性好，回收率高。同時，實驗對比了索氏提取法和05版藥典的液液萃取法，結果見表 3。可以明顯看出：兩者的回收率相當，均大于98%，但索氏萃取法的有機溶劑使用量卻遠遠小于液液萃取法的使用量，且操作時間比較短。故最終選擇采用索氏萃取法，萃取銀杏葉片中的萜類內酯。

4 結 論

銀杏葉的有效成分銀杏內酯對治療心腦血管疾病及多種復雜疾病時療效確切，隨著對銀杏葉制劑研究的逐步深入和臨床經驗的不斷積累, 它將能夠更廣泛地應用于治療各種疾病, 是一種很有前途和價值的藥物。我國是銀杏樹的主要產地, 我們應充分挖掘利用其資源, 讓它為我國人民的健康和我國的醫藥走向世界做出更大的貢獻。

表3 索氏提取法和05版藥典方法比較結果Table 3 The comparison results between soxhlet extraction and standard detection method in pharmacopoeia of version 2005

本文敘述了用索氏提取-HPLC- ELSD法檢測銀杏葉片銀杏內酯的含量。索氏提取簡便高效，且節省溶劑，保護環境，HPLC-ELSD方法靈敏度高且選擇性好。研究結果表明：本方法具有較好的線性范圍，精密度，穩定性，重復性，回收率和低的檢出限，可有效用于銀杏葉片中萜類內酯質量控制。

［1］中國藥典委員會.中國藥典2005年版一部正文[M].北京：中國醫藥科技出版社,2005.

［2］張麗穎. 銀杏葉的藥理研究及臨床應用近況[J]. 中國藥事, 2006,20(2) :114-117.

［3］ 余新建,劉育文,高麗麗,朱文娟,劉星. 銀杏內酯在心血管方面的應用研究探討[J].中國醫藥導報, 2008,5(9):172.

［4］ 劉大偉,武文斌. 銀杏葉中銀杏內酯的提取,分離和測定方法研究[J].科技創新導報,2011(25):9.

［5］ 劉彬果,張新萍,劉巖.銀杏葉片中萜類內酯類化合物的研究進展[J].藥學實踐雜志,2011,29(6):421-425.

［6］ 宋偉峰 李瑞明. HPLC- ELSD法測定銀杏葉茶中總內酯的含量[J].藥品鑒定,2011,18(5):40-43.

［7］ 肖飛,譚永霞,王永平,向陽, 趙娟.高效液相色譜-蒸發光散射檢測法測定銀杏葉片中 4 種萜類內酯含量[J].醫藥導報,2011,29(5):675-677.

Determination of Terpens Lactones in Ginkgo Leaves Tablets by Soxhlet Extraction-HPLC-ELSD Method

GAO Cui-hua，JIANG Heng
（School of Chemistry and Materials Science,Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001，China）

A green sample preparation technique based on Soxhlet extraction was established, and then HPLC- ELSD method was used to determine terpens lactones content in Ginkgo tablets. The results show that there are good linear relationships between ginkgolide A, B, C and bilobalide, recoveries all are above 98% and the detection limit is 52～108 ng. The method has excellent precision, stability and reproducibility, so it has the potential ability for extraction and determination of terpens lactones in ginkgo leaves tablets.

Ginkgo Leaves Tablets; Terpens lactones; Soxhlet extraction-HPLC-ELSD

O 657

A

1671-0460（2012）09-0999-04

2012-03-12

高翠華（1981-），女，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事綠色化學相關方面研究。E-mail：gaoch200906@126.com。