兒茶素及茶黃素單體間清除羥自由基能力研究

涂云飛，楊秀芳，孔俊豪，張士康，朱躍進，王盈峰

中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，杭州 310016

兒茶素及茶黃素單體間清除羥自由基能力研究

涂云飛*，楊秀芳，孔俊豪，張士康，朱躍進，王盈峰

中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，杭州 310016

本文通過二次通用旋轉回歸設計考察兒茶素體系和酯型兒茶素-茶黃素體系中各成分間的抗氧化能力強弱及相互間協同清除羥自由基能力。結果表明:兒茶素與茶黃素中的各成分隨含量增加，清除能力亦隨之增加，其中TF-D-G增加至一定濃度后，其效率有降低的趨勢。兒茶素體系中各成分清除羥自由基能力為:ECG＞EC＞EGCG，其中ECG的貢獻率達到了43%以上，而EGC在該體系中貢獻不明顯;酯型兒茶素-茶黃素體系中的羥自由基清除能力主要表現為:TF-D-G＞TF-M-G＞ECG＞EGCG＞TF，其中TF-D-G占對優勢(貢獻率為51.91%)，而兒茶素清除自由基能力卻未能有效發揮，每組中各成分之間的協同作用微弱。

兒茶素;茶黃素;羥自由基;化學發光;流動注射

圖1 表兒茶素與茶黃素結構Fig.1 Structure of Epi-catechins and theaflavins

茶鮮葉按不同的加工工藝［1］，可被制成綠茶，烏龍茶及紅茶。其中烏龍茶及紅茶中不僅含有兒茶素，還有一定量的兒茶素經酶促氧化聚合形成的茶黃素(結構如圖1所示)，這些成分不僅構成了茶葉的特征性品質成分，而且對人類健康的保護方面發揮了重要作用［2-5］。

通常，綠茶中酯型兒茶素比簡單兒茶素的摩而數高出約3～5倍［2，6，7］，而經酶促反應后，表型簡單兒茶素(EC和EGC)則會消耗怠盡，酯型兒茶素(EGCG和ECG)會有一定量的殘存。傳統工藝條件下，兒茶素的消耗與茶黃素的生成不成比例。有研究表明［8］，兒茶素的消耗可能是因為酚類酶促同時生成的雙氧水被過氧化物酶利用而產生的羥自由基攻擊兒茶素，降低了茶黃素的生物合成。然而至今未有實驗數據證實。因此本文模擬過氧化物酶分解過氧化氫，利用芬頓反應產生的羥自由基攻擊多酚類物質，目的是通過二次通用旋轉回設計探索兒茶素和茶黃素單體對羥自由基清除能力及其協同清除效果，從而有望為紅茶中兒茶素大量消除，而茶黃素未能成比例生成這一機理提供一些前期性的基礎研究結果，為提高紅茶中茶黃素含量作一些鋪墊性的工作。

1 材料與方法

1.1 試劑

兒茶素單體(上海友思生物技術有限公司);茶黃素單體自制［12］;硅膠(60～200目，島海洋化工廠);Sephadex LH-20(安瑪西亞有限公司);魯米諾(≥98%，蘇州工業園區亞科化學試劑有限公司)，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

IFFM-E型流動注射化學發光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司);分析天平(梅特勒 AL-204);定量加樣器(上海化科實驗器材有限公司)。

1.3 羥自由基清除能力測定

羥自由清除能力測定采用流動注射化學發光法［9］。即將雙氧水(8.4%，v/v)通過六通閥注射進入約100 μL定量環，再與含有魯米諾(2.0×10-4mol/L)、Fe2+-EDTA(6.0×10-2mol/L)及含兒茶素或茶黃素的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4，0.05 mol/L)載流相混合后進入光電倍增管，記錄化學發光信號。空白樣以水取代兒茶素或茶黃素進行實驗。其清除能力通過抑制發光體系(Fe2+-H2O2-魯米諾體系)［10］來衡量。清除率=(1-Si/S0)×100%，Si為實際發光面積，S0為空白發光面積。.

1.4 實驗設計

試驗在單因素的基礎上分兩組，組ⅰ為四個表兒茶素單體，組ⅱ為茶黃素單體與酯型表兒茶素間的羥自由基清除能力比較。實驗實施以二次通用旋轉回歸設計［11］為基礎，每一獨立變量的變化在5個無量綱編碼水平(-r，-1，0，+1，+r)，并確定了兒茶素與茶黃素單體因素的體積濃度變化范圍(見表1)。

表1 二次通用旋轉試驗水平編碼表Table 1 Coded levels of variables of the central composite experimental design

組ⅰ為31次實驗實施，包括16次因子設計實施，8次坐標軸點實施，和7次重復中心設計實施;組ⅱ為32次實驗實施，包括16次因子設計實施，10次坐標軸點實施，和6次重復中心設計實施，其實施結果見表2。

表2 二次通用回歸旋轉模型試驗設計方案及結果Table 2 General quadratic regression central composition design experiment and experimental result employed for evaluating the antioxidant ability

2 1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 80.01 66.88 3 1 1 -1 1 1 1 -1 1 -1 78.16 71.75 4 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 71.76 74.08 5 1 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 81.16 70.93 6 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 77.70 73.39 7 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 75.50 73.76 8 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 68.06 60.56 9 -1 1 1 1 -1 1 1 1 -1 77.19 69.77 10 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 72.69 70.49 11 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 1 68.72 74.66 12 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 60.55 60.22 13 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 1 75.93 73.47 14 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 71.51 62.84 15 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 68.84 64.70 16 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 58.02 68.97 17 2 0 0 0 2 0 0 0 0 77.07 74.98 18 -2 0 0 0 -2 0 0 0 0 66.48 67.46 19 0 2 0 0 0 2 0 0 0 74.61 71.15 20 0 -2 0 0 0 -2 0 0 0 72.62 67.13 21 0 0 2 0 0 0 2 0 0 80.29 72.93 22 0 0 -2 0 0 0 -2 0 0 62.65 70.39 23 0 0 0 2 0 0 0 2 0 77.59 70.74 24 0 0 0 -2 0 0 0 -2 0 67.78 66.31 25 0 0 0 0 0 0 0 0 2 73.06 74.31 26 0 0 0 0 0 0 0 0 -2 73.37 61.39 27 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72.85 69.98 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75.21 69.40 29 0 0 0 0 0 0 0 0 0 74.09 70.07 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 73.21 68.91 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 73.19 71.32 3200 0 0 0 78.24 69.48

1.5 試驗數據處理

數據的統計及響應面分析采用統計軟件Matlab6.0進行。并利用ANOVA評價各統計參數(P＜0.05表示差異顯著)。

2 結果

2.1 回歸模型的系數建立與檢驗

利用統計軟件對表2中的實施過程所取得的羥自由基清除率進行系數回歸與方差分析，結果如表3和表4所示。兩組體系中方程的回歸均顯著，組ⅰ與組ⅱ的P值均小于0.01，并且兩組數據的回歸方程的失擬性的概率P均大于0.05，說明方程能夠擬合真實值。

表3 次響應回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted mathematical model to an experimental data set using multiple regression

考慮到因子間存在交互作用，因此，各因素的一次，交互及二次項的回歸系數以P值與各因素的貢獻率綜合考慮，忽略各因素的P＜0.05，得到組ⅰ與組ⅱ的回歸方程為:

組ⅰ中，各因子的二次項均不顯著，同時交互項亦只有C1×3和C3×4項達到顯著水平，一次項中，除C2不顯著外，其余三因素均達到顯著水平，并且三因子的單因素水平的貢獻率超過80%。對于組ⅱ來說，各單因子均達到顯著性水平，二次項中，F1、F3、F5達到顯著水平，與組ⅰ相似，各因子的交互作用很微弱，并且ECG與TFDG分別為兩組中對于羥自由基的清除率具有絕對的優勢。

表4 二次通用旋轉回歸模型因子系數及清除能力貢獻率Table 4 Regression coefficients of the fitted quadratic equation and factor contribution ratio for the yield of antioxidant ability

C1×4-0.77 3.26 0.089 0.70 F14-0.28 1.52 0.24 0.02 C2×3-0.43 1.02 0.33 0.01 F15-0.30 1.80 0.21 0.07 C2×4-0.55 1.67 0.21 0.21 F23-0.75 11.39 0.0062 1.52 C3×4-1.39 10.51 0.0051 2.96 F240.097 0.19 0.67 -0.18 F25-0.36 2.64 0.13 0.19 F34-0.39 3.17 0.10 0.28 F35-0.82 13.51 0.0037 1.84 F45-1.09 24.12 0.00046 3.45

2.2 數學模型分析

2.2.1 主效應分析

各因素處理均經無量綱線性編碼代換，偏回歸系數已經不受因素取值的大小及單位的影響，其絕對值的大小直接反映了變量對響應值的影響程度。但是由于實驗因子存在交互作用，因此各因子對羥自由基的清除率的貢獻大小需進一步轉化成貢獻率來衡量。由表4可知，各組中因素間的清除能力按從強至弱的順序依次為:C3(43.96%)＞C1(26.76%)＞C4(17.25%);F5(51.91%)＞F4(15.54%)＞F1(9.71%)＞F2(3.42%)＞F3(2.44%)。比較兩組結果，雖然兒茶素組中的ECG在該體系中抗氧化能力較強，但是當與茶黃素混合后的新體系中，酯型兒茶素ECG發揮清除羥自由基的能力明顯降低，取而代之的是酯型茶黃素。

2.2.2 單因素效應分析

將回歸模型中三個固定在零水平，得到的單因素模型分別為:

將4個因素固定在γ、1、0、-1、-γ水平，得到各因子的單因素效果圖2。從圖中可以明顯看出，組ⅰ(圖2-A)中各因素的效應隨著自變量的變化直線走向，并且C3的斜率最大，其余次之。而組ⅱ(圖2-B)中，茶黃素雙沒食子酸酯呈現出拋物線狀，從左至右呈現出先快速增長后趨緩的態勢。而F3呈現出開口向上的拋物線狀說明有最小值點。其余成分變化趨于線性，即在實驗范圍內，每組中的成分對羥自由基的影響主要表現為含量越高，清除能力越大。

圖2 各單因素水平與清除率的回歸曲線Fig.2 Regression curve of scavenge and the levels of each component

2.2.3 單因素邊際效應分析

單因素邊際效應在二級響應面交互作用條件下，主要反應清除率隨各因子水平的變化而變化的速率。為了確定各因素的邊際效應，將上述所得方程進行單因素求導，各方程如下:

從上圖中可以看出，茶黃素及茶黃素單沒食子酸酯隨著編碼值的增加，清除速率快速上升，同時茶黃素雙沒食子酸酯(F5)的清除速率主要表現為隨編碼值的增加而急劇下降，這亦間接說明，雖然茶黃素雙沒食子酸酯(F5)的濃度增加可以增強羥自由基的清除率，但低濃度時清除自由基的效率更高，而對于茶黃素(F3)及單沒食子酸酯(F4)則表現出隨濃度的增加，清除羥自由基的效果呈現出上升的趨勢。

圖3 各單因素邊際效應Fig.3 Marginal utility of scavenge of each component

2.2.4 兩因素互作效應分析

在組1中，分別將兩個因素固定在零水平，得到另外兩個因素的模型。分別為，根據模型做出的響應面和等高線圖。

圖4-C說明兒茶素(組ⅰ)中除了C1×3與C3×4因子間的微作用外，主要表現為相互間的交互作用很弱，這主要體現在各水平的等高線呈現出平等的直線。而對于圖4-D來說，響應面則被雙因素間的交互作用而扭曲，但是相對于單因素來說，交互作用依然較弱，其總貢獻率不足7%。

3 討論

兒茶素單體在清除自由基或抑制脂質過氧化能力方面，不同的研究體系結果表明酯型兒茶素強于簡單兒茶素，并且酯型或簡單兒茶素中存在著表沒食子型與表兒茶素型強弱順序不定的差異［12-14］，然而這些結果都是基于兒茶素單體獨立的抗氧化效果。筆者通過將四種兒茶素同時暴露于活性氧羥自由基時，則主要表現為表兒茶素型(ECG和EC)強于表沒食子型兒茶素(EGCG和EGC)，這可能是由于兒茶素在清除羥自由基時，有著兩種類型相互間自修復作用［15，16］，達到重復利用的可能，從而增強表型兒茶素的抗氧化能力。另一方面，表型與表沒食子型兒茶素的B環4位酚羥基發生抽氫后，表型兒茶素B環上的2位芐氫比表沒食子型兒茶素B環上的3或5位酚羥基更易于發生抽氫反應［17］，從而導致表型兒茶素在清除自由時處于優勢地位。

對于酯型兒茶素-茶黃素體系，茶黃素單或雙沒食子酸酯＞酯型兒茶素＞茶黃素。在該體系中，茶黃素雙沒食子酸酯對于羥自由清除的貢獻率高于50%，這與兒茶素及茶黃素結構中的沒食子基具有穩定兒茶醌或茶黃醌的作用相符合［18］。同時，這也可以間接說明高茶黃素與兒茶素提取物可更好的改善心腦血管疾病的性狀［4］，因為茶黃素與兒茶素的聯用增強了酯型茶黃素的清除羥自由基能力而發揮作用。

另有研究表明［6，19］在茶鮮葉酶促發酵中表兒茶素在氧化的同時，會降低生成的茶黃素及茶黃素單沒食子酸酯，而對茶黃素雙沒食子酸酯的影響較小，同時簡單兒茶素則消耗較小，說明茶黃素與兒茶素在同一體系中共同清除自由基時，相對弱的兒茶素或茶黃素充當修復劑的作用，而保護了先被自由基攻擊的抗氧化物質。

4 結論

兒茶素與茶黃素的抗氧化能力主要表現為單因子獨立效應，并且各組中ECG或TF-DG在該體系清除自由基中發揮了將近一半的作用，而其余成分則是發揮著補充修復的作用。兩組中各因素的交互作用相對來說弱很多。另外，雖然大量關于兒茶素及茶黃素的抗氧化能力的強弱研究，但是對于茶鮮葉中的茶黃素含量偏低于理論含量，至今仍然不清。更好的基礎性的理解涉及到關于兒茶素在氧化過程中的自由基的生成，所以需要研究清楚。至此，更進一步的研究關于兒茶素的酶促氧化及茶黃素合成仍需要進行詳細的研究，這不僅關系到茶葉的品質，更重要的是讓茶葉發揮應有的保健功效，其意義深遠。

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Antioxidant Capability of Epi-catechins and Theaflavins In Vitro by Scavenging Hydroxyl Free Radical

TU Yun-fei*，YANG Xiu-fang，KONG Jun-hao，ZHANG Shi-kang，ZHU Yue-jin，WANG Yin-feng
Hangzhou Tea research institute，All-China Federation of Supply and Marketing Co-operatives，Hangzhou 310016，China

In this paper，the scavenge ability of hydrogen free radical for both catechins(groupⅰ)and gallate catechintheaflavins(groupⅱ)was investigated by the method of quadratic general rotate regression design.The results indicated that the scavenge ability of each group increased along with the increasing content of each component in the system，except for TF-D-G which mainly played important role at the low concentration.In groupⅰ，the scavenge ability of of each component was in order of ECG＞EC＞EGCG，and the contribution ratio of ECG in this system was more than 43%，which in sharp contrast to negligible component of EGC.As for groupⅱ，the order of each component in the scavenge ability was TF-D-G＞TF-M-G＞ECG＞EGCG＞TF，and the contribution ratio of TF-D-G exceeded 50%.Interestingly，the gallate catechins could not effectively play the role of scavenging the hydrogen free radicals when they mixed with theaflavins.And the synergy effect of components in corresponding group was weak.

catechins;theaflavins;hydrogen free radical;chemiluminescence;flow injection analysis

Q599.5

A

1001-6880(2012)05-0653-07

2011-06-07 接受日期:2011-10-31

浙江省自然科學基金項目(Y3100683)

*通訊作者 Tel:86-571-86032092;E-mail:tyfaf@sohu.com