十六種晉產北柴胡柴胡皂苷含量分析

周 瓊，郝建平，高可青，關 倩

山西大學生命科學學院，太原 030006

十六種晉產北柴胡柴胡皂苷含量分析

周 瓊，郝建平*，高可青，關 倩

山西大學生命科學學院，太原 030006

本實驗分別以高效液相色譜法和分光光度法測定了山西省十三個產地的16種北柴胡中柴胡皂苷a、d及柴胡總皂苷的含量。結果表明，在16種晉產北柴胡中，柴胡皂苷a的質量分數為0.038%～0.369%，柴胡皂苷d的質量分數為0.036%～0.681%，柴胡總皂苷的質量分數為0.354%～3.949%;12種晉產北柴胡中的柴胡皂苷a、10種中的柴胡皂苷d和13種中的柴胡總皂苷含量分別超過了0.1%、0.2%和1.0%。

北柴胡;柴胡皂苷;高效液相色譜法;分光光度法

北柴胡(Bupleurum chinense DC.)是傘形科柴胡屬多年生草本植物，也是《中國藥典》規定的柴胡正品藥材的原植物［1］。柴胡以根入藥，是常用大宗中藥材。長期不合理的濫采亂挖導致野生北柴胡資源趨于枯竭，現在柴胡藥材的供應以家種品為主。由于栽培類型種源混雜和種性退化，在北柴胡人工種植中普遍存在藥材產量不高、質量均一性差和療效穩定性不好等問題。北柴胡廣泛分布于山西省的86個縣市［2］，是山西省的道地藥材。本實驗對采自山西省十三個主要種植、分布縣(市)的16種栽培和野生北柴胡的根進行了皂苷含量的測定與比較，旨在為北柴胡的種質選育提供參考依據。

1 儀器及試劑

1.1 材料來源

供試材料分別采集于山西省的長治市及萬榮、夏縣、稷山、和順、左權、陵川、平定、盂縣、交城、陽曲、定襄、右玉等十三個縣。

1.2 實驗儀器

高效液相色譜儀(美國Waters，Breeze色譜工作站，1525泵，2487紫外檢測器)，Hypersil ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱(中國科學院大連化學物理研究所)，UNICO UV-2100紫外可見分光光度計，超聲波細胞破碎儀等。

1.3 實驗試劑

乙腈為色譜純試劑(美國天地公司)，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品(純度＞98.0%，上海中藥標準化研究中心)。

2 實驗方法

2.1 HPLC測定柴胡皂苷a和d的含量

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:室溫;UV檢測波長:250 nm;流動相:乙腈-水(40∶60);流速:1.0 mL/min。

2.1.2 樣品溶液的制備

將每個產地的北柴胡根烘干后稱量0.5 g并研磨至粉末，用8%的氨水甲醇25 mL索氏提取1 h，提取3次;過濾蒸干，用甲醇定容至25 mL;取其中1 mL，加1 mL 8%的 HCl-CH3OH，30℃下反應24 h［3］;然后加入8%KOH-CH3OH中和，甲醇定容至5 mL。

2.1.3 柴胡皂苷a和d對照品溶液的配制

精確稱取柴胡皂苷a對照品1.3 mg和柴胡皂苷d對照品1.1 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容，搖勻。

2.1.4 標準曲線的繪制

量取0.13 mg/mL柴胡皂苷a對照品溶液10、20、30、40、50、60、70和80 μL，分別置于5 mL容量瓶中，加8%的HCl-CH3OH溶液1 mL，30℃下反應24 h，再加8%KOH-CH3OH溶液1 mL，用甲醇定容，搖勻。分別取20 μL上述溶液注入色譜儀，按“2.1.1”項下的色譜條件測定峰面積。以峰面積值為縱坐標，柴胡皂苷a的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程:Y=26511X-3493.7，R2=0.9944。取柴胡皂苷d對照品溶液重復上述步驟，得回歸方程Y=29527X-21843，R2=0.9946。

2.2 分光光度法測定柴胡總皂苷

2.2.1 樣品溶液的制備

稱取各樣品粗粉0.5 g，置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL 2%的KOH-CH3OH，用超聲波細胞破碎儀處理30 min，冷卻，搖勻。

2.2.2 標準曲線的繪制

量取1 mg/mL柴胡皂苷d的對照品溶液25、30、50、75、100、125和150 μL，水浴蒸發去溶媒后分別加入1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL，蒸干，加85%磷酸4 mL，70℃下加熱30 min，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，以545 nm為檢測波長，測定吸光度。以吸光度值為縱坐標，柴胡皂苷d的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程 Y= 32.8X-0.0005，R2=0.9966。

3 結果與分析

3.1 柴胡皂苷a和d的含量測定

3.1.1 精密度試驗

分別量取1.3 mg/mL柴胡皂苷a對照品溶液和1.1 mg/mL柴胡皂苷d對照品溶液各20 μL，置于5 mL容量瓶中，加8%的HCl-CH3OH溶液1 mL， 30℃下反應24 h，再加8%KOH-CH3OH溶液1 mL，用甲醇定容，搖勻。取反應后柴胡皂苷混合標準溶液按照“2.1.1”色譜條件進行HPLC測定，重復五次，得到的柴胡皂苷a和d峰面積的RSD分別為1.95%和0.57%，結果表明精密度良好。標準品柴胡皂苷a和d的HPLC圖譜如圖1。

圖1 標準品柴胡皂苷a和d的HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of saikosaponin a and saikosaponin d

圖1中，峰值5.509為柴胡皂苷a標準品，峰值7.9339為柴胡皂苷d標準品。由圖1可知，采用高效液相色譜法對晉產不同類型的北柴胡根中柴胡皂苷a和d的含量進行測定，目標峰清晰穩定，方法簡便可行，可作為實驗室測定柴胡皂苷a、d的方法［4］。

3.1.2 穩定性試驗

隨機取1號樣品(見表1，下同)五份，按“2.1.2”制備樣品溶液，在0、2、4、6、8 h時進行HPLC測定。柴胡皂苷a和d的測定結果的RSD分別為0.78%和1.46%，表明樣品在8 h內穩定性良好。

3.1.3 重復性試驗

隨機取5號樣品，精密稱取五份，按照“2.1.2”項制備樣品溶液，在“2.1.1”的條件下測定，柴胡皂苷a和 d的測定結果的 RSD分別為1.46%和0.97%，表明重復性良好。

3.1.4 回收率試驗

稱取已知含量的北柴胡細粉，加入1 mL的柴胡皂苷d的標準品，按照樣品測定方法測定，計算出回收率的RSD為1.47%。

3.1.5 樣品的測定

量取“2.1.2”制備的各樣品溶液20 μL，過0.45 μm濾膜，注入色譜儀，按照“2.1.1”項下色譜條件測定峰面積，計算其含量，結果見表1。

3.2 柴胡總皂苷含量測定

3.2.1 精密度試驗

取柴胡皂苷d對照品溶液，以蒸餾水為空白，在545 nm處測定吸光度，連續測定五次，所得RSD為1.57%，表明精密度良好。

3.2.2 穩定性試驗

分別稱取1號、11號和14號樣品，每隔10 min測定一次總皂苷，連續測量五次，并在24 h后重復進行測量，所得RSD均小于3%，表明樣品在24 h內比較穩定。

3.2.3 重復性試驗

隨機取16號樣品，精密稱取五次，按照“2.1.1”項制備樣品溶液，以蒸餾水為空白，在545 nm處測定吸光度，所得RSD為2.06%，表明重復性良好。

3.2.4 回收率試驗

稱取已知含量的北柴胡根細粉，加入1 mL的柴胡皂苷d的標準品，按照樣品測定方法測定，計算出回收率的RSD為2.34%。

3.2.5 樣品的測定

量取“2.1.1”項下的樣品溶液10 mL，置蒸發皿中于水浴上蒸干，殘渣加正丁醇飽和的水10 mL，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取三次，每次用量分別為20、10和10 mL，合并正丁醇層，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇溶液溶解，定容至10 mL容量瓶中，搖勻。再移取此甲醇溶液0.5 mL，蒸去溶媒后加1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL，蒸干，加85%磷酸4 mL，70℃下加熱30 min，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，在545 nm處測定吸光度，測定結果如表1。

表1 晉產北柴胡樣品中的柴胡皂苷含量Table 1 The content of each component in the samples ofB.chinensefrom Shanxi

按照柴胡皂苷a的質量分數不低于0.1%，柴胡皂苷d的質量分數不低于0.2%，柴胡總皂苷的質量分數不低于1.0%質量控制指標的要求［4-7］，在十三個產地的16種樣品中，除了長治老頂山、交城、交城龐泉溝和定襄北柴胡外，其余12種中的柴胡皂苷a的質量分數均達到質量控制指標，其中以產自陵川六泉的北柴胡的含量最高，為0.369%;除了長治老頂山、平定、交城、交城龐泉溝、定襄和右玉北柴胡外，其余10種中的柴胡皂苷d的質量分數達到質量控制指標，其中以產自陽曲的北柴胡的含量最高，為0.681%;除了長治老頂山、交城、交城龐泉溝北柴胡外，其余13種中柴胡總皂苷的質量分數達到質量控制指標，其中以秋季夏縣采集的含量最高，達3.949%。由表1也可以看出，在16種樣品中，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及柴胡總皂苷三者之間不存在正比關系，柴胡皂苷a或d含量的高低必然會影響到總皂苷的含量;柴胡皂苷a含量高的類型其柴胡皂苷d的含量不一定高，反之亦然［8］。因此，不宜單獨用其中一種成分含量的高低來評價其質量的好壞，藥材質量的評價標準應當考慮多方面的因素。

除了一種夏縣北柴胡根采集自2010年10月外，其余15種樣品均采集于2010年5～6月。采自陵川縣六泉鄉、左權縣、長治老頂山、定襄縣、和順縣和交城龐泉溝的6個類型為野生類型，其余10種均為兩年生栽培型。六種野生北柴胡根的生長年份難以準確確定，但其直徑均與10種栽培類型基本相當。測定結果反映了各類型北柴胡根中皂苷的相對含量以及基因型的差異，可以作為優良類型人工馴化、種植乃至種質培育的參考指標。

表2 晉產北柴胡生態環境Table 2 Environments ofB.chinensefrom Shanxi

表2為各晉產北柴胡產地的生態環境，表中數據來自當地氣象資料。綜合表1和表2結果，以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及柴胡總皂苷的絕對含量以及北柴胡喜稍冷晾且濕潤的氣候與耐寒、耐旱、忌高溫、忌澇洼積水特點為依據［9］，參考“北柴胡適生地分析及數值區劃研究”［2］的結果，可以得出如下結論:適合晉產北柴胡生長的地區一般地理及氣候條件為:海拔1200～1400 m，氣候以暖溫帶大陸性季風氣候為主，年平均降水量在450 mm左右。

1 Pharmacopoeia editorial committee of the ministry of health.Chinese Pharmacopoeia(First).Beijing:People's Health Publishing house，2005，198.

2 Chen SL(陳士林)，Xiao PG(肖培根).Introduction to the Sustainable Utilization of Chinese Herbal Medicine Resources.Beijing:China Medical Science and Technology Publishing House，2006.

3 Li YY(李媛媛)，Qin XM(秦雪梅)，Wang YQ(王玉慶)，et al.Determination of content of saikoside inBupleurum chinensefrom different sources.China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2008，33:237-239.

4 Bai XM(白雪梅)，Tian JM(田嘉銘)，Wang DB(王德寶).HPLC determination of different origin saikosaponin a and d levels.Chin Tradit Patent Med(中成藥)，2006，28:440-441.

5 Zhang D(張岱).Compare of the content of total saponin inBupleurumfrom different sources.Tianjin Pharm(天津藥學)，2001，13:60.

6 Li YY(李媛媛)，Qin XM(秦雪梅)，Wang YQ(王玉慶)，et al.Association of differentBupleurum chinenseDC.cultivars with contents of active components.J Shanxi Coll Tradit Chin Med(山西中醫學院學報)，2007，8:44.

7 Kong LL(孔伶俐)，Cui QJ(崔青娟)，Shi DS(史德勝)，et al.HPLC determination of saikosaponin content of saikosaponin a.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2004，35:643-644.

8 Wang P(王鵬)，Jia LY(賈凌云)，Sun QS(孫啟時)，et al.Determination of the content of saikoside inBupleurum chinenseDC.from different sources.J Shenyang Pharm Univ(沈陽藥科大學學報)，2004，21:193-195.

9 Wang YP(王英平).The Key of Raise Seedlings Technologies.Beijing:China Agriculture Press(中國農業出版社)，2005.

Analysis on Saikosaponin of Sixteen Bupleurum chinense from Shanxi

ZHOU Qiong，HAO Jian-ping*，GAO Ke-qing，GUAN Qian
School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China

Saikosaponins a and d were used as the chemical reference substance to establish HPLC and visible-spectrophotometry methods for determination of total contents of saikosaponin in sixteen kinds ofBupleurum chinensefrom thirteen production areas in Shanxi province.The results showed that the contents of saikosaponins a and d and the total saikosaponin inB.chinensewere 0.038% ～0.369%，0.036%～0.681%，and 0.354% ～3.949%，respectively.In addition，the contents of saikosaponin a in 12 species，saikosaponin d in 10 species，and the total saikosaponin in 13 species were more than 0.1%，0.2%and 1.0%，respectively.

Bupleurum chinenseDC.;saikosaponin;HPLC;visible-spectrophotometry

Q284.2

A

1001-6880(2012)05-0644-04

2011-04-14 接受日期:2011-08-31

山西省科技攻關計劃項目(20100311091)

*通訊作者 Tel:86-013935168866;E-mail:jphao@sxu.edu.cn