維生素K3增強三氧化二砷誘導多發性骨髓瘤細胞凋亡的實驗研究

鄧 姝 沈建平 沈一平 林圣云 胡致平 鄭智茵 周郁鴻

(浙江省中醫藥大學附屬第一醫院血液科，浙江省杭州市郵電路54號，310006)

多發性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一種漿細胞惡性腫瘤。目前，對于晚期、復發和耐藥MM患者的治療仍然是一個難題。已有研究表明三氧化二砷(As2O3)在體外能夠抑制骨髓瘤細胞的增殖并誘導凋亡［1］本實驗通過研究 As2O3聯合維生素 K3對 RPMI8226細胞增殖與凋亡的影響，期望為臨床合理應用As2O3，治療MM提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 人多發性骨髓瘤細胞株RPMI8226由本科室長期保存，實驗從－80℃冰箱取出，快速復蘇后傳代培養備用。培養基為RPMI－1640培養液，于37℃，5%CO2培養箱培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2 主要試劑及儀器 RPMI1640培養液:Sigma公司產品。小牛血清:杭州四季青生物工程材料研究所產品。四甲基噻唑氮藍(MTT，華美生物工程公司)，二甲亞砜(Sigma公司);Annexin－V－FITC凋亡檢測試劑盒(深圳晶美公司)。As2O3注射液(黑龍江伊達藥業公司)，維生素K3(無錫第七制藥廠)，兩藥使用前均用不含血清的RPMI－1640稀釋至所需濃度。FACS Calibur型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 實驗分組 根據所加藥物不同分為4組，依次為空白對照組、維生素K3組、As2O3組、維生素K3+As2O3組。細胞培養取對數生長期細胞，以RPMI－1640培養液調整細胞濃度至2×105/mL。在24孔培養板中分別加入2mL細胞懸液。空白對照組加入培養液。維生素 K3組加入維生素 K3，濃度分別為2μmol/L，5μmol/L，10μmol/L。As2O3組加入 As2O3，使其終濃度為2μmol/L。維生素K3+As2O3組同時加入維生素K3和As2O3，各孔細胞懸液中As2O3的終濃度均為5μmol/L，維生素K3的終濃度分別為2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L(根據參考文獻及多次預實驗確定)。加藥后 12h、24h、48h、72h 收集細胞。

1.3.2 MTT實驗 用含10%小牛血清的RPMI－1640培養液將對數生長期的RPMI8226細胞配制成5×105個/mL細胞懸液，每孔200μL加入96孔培養板內。分別以不同的時間點和藥物濃度作為一組，每組均設3個復孔及1個對照孔，對照孔加入空白對照孔的細胞。然后每孔加入5mg/mL MTT 20μL，再培養4h，離心，棄上清，每孔加200μL二甲亞砜，振搖至結晶溶解后用酶聯儀測定吸光度A值(測試波長600nm)。以該組復孔的平均值作為該組細胞的A值。細胞生長抑制率=1－(A實驗/A對照)×100%。

1.3.3 細胞周期檢測 藥物與RPMI8226細胞共同培養48h，每組收集1×106個細胞，70%(體積分數)乙醇4℃固定過夜，加入RNA酶，37℃水浴消化15～30min 以上，加入 PI，4℃存放 20min，加入適量 PBS，上流式細胞儀檢測。重復實驗3次。

1.3.4 流式細胞術AnnexinV/PI標記法檢測凋亡As2O3及維生素K3單獨及聯合作用RPMI8226細胞同上，實驗按照說明書操作，細胞周期檢測藥物與RPMI8226細胞共同培養48h，離心收集細胞106，PBS洗兩次，用1×binding buffer 490μL重懸細胞，然后加入FITC(異硫氰酸熒光素)標記的Annexin V(FITC－Annexin V)和PI各5μL，置冰上作用10min，然后上流式細胞儀檢測分析。重復實驗3次。

1.4 統計分析 采用SPSS10.0統計軟件做單因素方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 As2O3和As2O3聯合維生素K3對RPMI8226細胞的生長抑制作用 單用2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L維生素K3對RPMI8226細胞生長有一定的抑制作用，且其作用呈時間和劑量依賴性;單用 2μmol/LAs2O3對 RPMI8226細胞生長有一定抑制作用，2μmol/LAs2O3聯合維生素K3對RPMI8226細胞生長抑制作用與維生素K3劑量和作用時間有關，2μmol/LAs2O3聯合 2、5、10μmol/L 維生素 K3作用 48h、72h對RPMI8226細胞生長抑制顯著(P＜0.05)。

2.2 DNA含量分析 2μmol/LAs2O3作用于 RPMI8226細胞48h后，出現G0/G1期細胞增高，S期減少;2μmol/L As2O3聯合5μmol/L維生素 K3作用于RPMI8226細胞48h后，出現G0/G1期細胞增高，S期降低，且2μmol/L As2O3聯合5μmol/L維生素K3較單用2μmol/L As2O3后G0/G1期細胞增高，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 As2O3和As2O3聯合維生素K3對RPMI8226細胞的凋亡率影響 2μmol/LAs2O3和2μmol/LAs2O3聯合5μmol/L維生素K3作用于RPMI8226細胞48h后，細胞凋亡率較空白對照組顯著增高(P＜0.05)，且2μmol/L As2O3聯合 5μmol/L維生素 K3較單用2μmol/L As2O3細胞凋亡率增高，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 示不同濃度的維生素K3和As2O3單獨及聯合作用48hRPMI8226細胞的凋亡率

不同劑量的As2O3、維生素K3單獨及聯合作用48h后細胞的凋亡率。分別為對照組，2μmol/L As2O3，2μmol/L As2O3+5μmol/L 維 生 素 K3組，2μmol/L As2O3+10μmol/L 維生素 K3組。

3 討論

As2O3是中藥砒霜的主要成分，隨著醫學的發展，砷的毒理、藥理研究也有了進展，As2O3在體外可以誘導多種腫瘤細胞凋亡［2－3］。本實驗表明:As2O3與維生素K3聯合作用明顯提高了RPMl 8226細胞對As2O3的敏感性、S期細胞減少、使MM細胞阻滯于G1期，并抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。這與砷劑能使淋系腫瘤發生G1期阻滯和使NB4細胞發生G2/M期阻滯結果一致［4］。近年來國外不少學者報道，維生素K3對某些腫瘤細胞系的增殖具有抑制作用，并能誘導腫瘤細胞發生凋亡［5］。近年來國外不少學者報道，維生素K3對某些腫瘤細胞系的增殖具有抑制作用，并能誘導腫瘤細胞發生凋亡［6］。用As2O3與維生素K3聯合治療MM，可以減少As2O3的用量，降低砷劑對機體的毒性，起到增效減毒的作用，為臨床治療復發、難治MM提供了新思路。

［1］Grad J M，Balis N J，Krett N，et al.Arsenic trioxide uses caspasedependent and caspase － independent pathways in myeloma cells［J］.Mol Cancer Ther，2003，2(11):1155 －1164.

［2］YI Jing，YANG Jie，HE Rong，et al.Emodin enhances arsenicinducedapoptosis via generation of reactive oxygen species andinhibition of survival signaling［J］.Cancer Res，2004，64:108 －116.

［3］周宇紅，黃曉瑞，蔡循，等.三氧化二砷誘導骨髓瘤細胞凋亡機制研究［J］.中華腫瘤雜志，2001，23(3):181 －183.

［4］Rousselot P，Labaume S，Marolleau J P，et al.Arsenic t rioxide and melarsoprol induce apoptosis in plasma cell lines and in plasma cells f rom myeloma patient s.Cancer Res，1999，59:1041 －1048.

［5］徐波，王潔，卞度宏.三氧化二砷體外誘導宮頸癌細胞株凋亡及其機制的研究［J］.實用醫學雜志，2006，22(3):245 －247.

［6］Rajkumar S V，Leong T，Roche PC，etal.Prognostic value of bone marrow angiogenesis in multiple myeloma［J］.Clin Cancer Res，2000，6(8):3111－3116.