血必凈對急性肺損傷兔模型中NF-κB信號通路的影響及其臨床意義

趙容順 單浩洪 吳偉鴻

1.廣東省增城巿中醫醫院外科，廣東增城 510000；2.廣東省廣州市第十二人民醫院，廣東廣州 510620

急性肺損傷（ALI）是常見的急危重癥。ALI的基本發生機制為細胞因子的過度表達及相互之間的復雜作用，使肺毛細血管通透性增加，液體、溶質和細胞成分遷移至間質及肺泡腔，產生肺水腫[1]。ALI目前尚無特異治療方法，在眾多細胞因子中，核因子-κB（NF-κB）調控多種細胞因子和炎癥介質的轉錄表達，在ALI的發病過程中發揮著重要作用。本研究基于中醫學理論及筆者的臨床經驗，結合現代醫學研究進展，通過制備內毒素型急性肺損傷兔模型，觀察中藥制劑血必凈注射液對ALI肺組織NF-κB的活性變化，探討血必凈注射液是否通過拮抗內毒素、抑制炎性介質釋放和保護內皮功能等機制而發揮治療作用，為中西醫結合方法治療ALI提供理論依據，提高搶救成功率。

1 材料與方法

1.1 材料

脂多糖、內毒素脂多糖（LPS）及試劑盒購自廣州晶美生物技術有限公司（代理美國Sigma公司產品）。NF-κB的同源結合序列由北京奧科生物技術公司合成并行末端生物素標記。血必凈注射液由天津紅日藥業股份有限公司提供，批準文號：Z20040033，每支10 mL。有效成分是由中藥原料藥紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸中提取，其提取物的有效成分包括紅花黃色素A、川芎嗪、丹參素、阿魏酸、芍藥苷、原兒茶醛等。其中紅花黃色素A濃度＞0.5mg/mL，芍藥苷濃度＞1.0 mg/mL，阿魏酸濃度＞0.01 mg/mL。

1.2 動物模型及分組

1.2.1 分組 取新西蘭兔80只（雄性），體重2.0～2.5kg，按隨機方法分為四組：空白對照組、單純急性肺損傷（LPS）組、單純血必凈（XBJ）組、血必凈治療（LPS+XBJ）組，各 20 只。

1.2.2 動物模型制作 1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉，經耳緣靜脈注入內毒素LPS，制成急性肺損傷的動物模型。

1.2.3 干預方法 空白對照組給予生理鹽水10 mL注射，LPS組僅注射 LPS 5mg/kg，XBJ組僅注射血必凈 5mL/kg，LPS+XBJ組注射LPS 5mg/kg+血必凈5mL/kg靜脈注射。

1.3 觀察指標及標準

1.3.1 血流動力學變化 通過生物多導儀觀察實驗前后血流動力學變化，包括呼吸頻率、心率、體溫、動脈和靜脈氧分壓、體重等，在所需觀察時間內抽取血液標本。

1.3.2 動物模型制作成功的病理指標 LPS致傷后半小時處死動物，肺臟體積增大，表面可見大小不等的暗紅色斑片狀病灶，切面可有淡紅或白色泡沫樣液體溢出；光鏡下觀察，肺組織內有白細胞浸潤，可見肺間質及肺泡水腫，肺出血明顯。肺組織濕/干（W/D）比值明顯升高。

1.3.3 肺組織病理形態變化 于12、24、36、48 h分批處死后分離肺組織后，取右肺組織進行組織切片在光鏡、電鏡觀察病理形態變化。

1.3.4 NF-κB活性測定分離左肺組織，采用4℃生理鹽水進行左肺灌洗，收集灌洗液，取搖勻的灌洗液原液1 滴，作細胞總數計數。灌洗液離心，細胞沉渣涂片做Wrigh-Giemsa染色，鏡下分類，計數巨噬細胞、中性粒細胞（PMN），采用凝膠電泳遷延率法 （EMSA）加計算機輔助圖像分析技術檢測白細胞NF-κB活性（按試劑盒說明操作）。

1.4 統計學方法

使用SPSS 12.0統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，重復測量的計量資料采用方差分析，樣本均數之間的兩兩比較用q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

與空白對照組比較，LPS組各時間點肺組織NF-κB表達量均明顯增高（P＜0.01）；與LPS組相同時間點比較，LPS＋XBJ組24、36、48 h肺組織 NF-κB表達量明顯減少（P ＜ 0.01）；與空白對照組比較，XBJ組各時間點肺組織NF-κB表達量有一定減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同組別各時期肺組織NF-κB含量比較（±s）

表1 不同組別各時期肺組織NF-κB含量比較（±s）

注：與空白對照組比較，P＜0.01；與LPS組比較，P＜0.01

組別 12 h（n=5） 24 h（n=5） 36 h（n=5） 48 h（n=5）空白對照組LPS組XBJ組LPS＋XBJ組42.7±12.8 207.5±87.2*41.5±11.3 185.2±84.8 41.9±11.5320.8±109.2*40.9±10.5121.2±59.2△42.3±13.2 408.3±102.5*39.1±9.8 92.7±42.8△42.5±12.5401.7±97.6*41.0±10.3 65.8±27.3△*△

3 討論

既往臨床報道顯示，接近半數的膿毒癥患者發生ALI，進而發展成為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），后者為膿毒癥患者的主要死因之一。ALI發生時，肺組織中炎性因子大量表達，參與ARDS的發生發展。NF-κB是一組可被數百種上游因子激活的多效因子，其通過多條信號通路參與復雜的炎癥反應。既往研究顯示，NF-κB是膿毒癥炎癥反應的樞紐環節，其上游因子包括TLRs、TNF-α、COX-2 等，由于單純下調某一上游因子并不能從根本上阻止ALI的進展，因此本研究選取NF-κB作為研究對象。

張克君等[2]向大鼠胰膽管逆行注入5%牛磺膽酸鈉誘導ALI模型，結果發現肺組織NF-κB在6 h后開始增加，24 h增加最明顯，而給予NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）的干預組，各時間點相應肺組織NF-κB含量明顯降低，且NF-κB的下游因子PUMA表達水平亦明顯降低，肺泡Ⅱ型細胞上皮凋亡明顯較模型組輕。故他們認為NF-κB活化進而上調下游因子PUMA表達，促進肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡，而在ALI過程中發揮重要作用。本實驗的結果顯示，兔在注射LPS誘導ALI后，病程早中期NF-κB大量表達，至36 h達到峰值，隨后逐漸平穩并出現降低趨勢，提示在ALI的早中期，促炎反應占優勢，而后期則轉為抗炎反應占優勢。由于ALI發展成為ARDS的根本原因在于內毒素可造成大量炎性介質釋放，產生“瀑布”效應，促抗炎平衡隨之被破壞。而NF-κB是ALI中發揮重要角色的因子，其在多條炎性通路中占據上游位置，阻斷NF-κB的活化，就可能抑制肺組織細胞的凋亡過程，延緩ALI的發展。血必凈是由丹參、當歸、赤芍、川芎、紅花五味中藥經現代制藥工藝提取其有效成分制成，主要成分為丹參素、芍藥苷、阿魏酸、紅花黃色素、川芎嗪等，既往動物實驗及臨床資料均顯示血必凈具有降低MODS死亡率的作用[3-6]。本次研究結果顯示，血必凈顯著抑制了ALI兔模型的NF-κB表達，從而減輕了ALI，而未注射內毒素的XBJ組并未表現出NF-κB表達的明顯抑制，提示血必凈可能通過對內毒素的抑制作用阻斷NF-κB的活化過程，而對正常機體的NF-κB信號通路無明顯影響。

綜上所述，血必凈可通過下調ALI肺組織中NF-κB的表達水平，阻斷其介導的炎癥反應通路，抑制肺組織細胞的凋亡過程，而對正常肺組織中的NF-κB表達并無明顯影響，具有顯著的臨床應用價值。血必凈的具體作用機制及其是否對內毒素產生直接的抑制作用，尚需要進一步的實驗研究證實。

[1] Maniatis NA，Kotanidou A，Catravas JD.Endothelial pathomechanisms in acute lung injury[J].Vascu Pharmacol，2008，49：119-133.

[2] 張克君，宋彩霞，焦學龍，等.NF-κB和PUMA與重癥胰腺炎致急性肺損傷的關系以及PDTC的干預作用[J].中華急診醫學雜志，2010，19（9）：921-926.

[3] 陳紅梅，李艷靜，王進科，等.中藥調控NF-κB活性的研究進展[J].藥學與臨床研究，2008，16（2）：118-124.

[4] 張景榮，張高峰，鞠萍，等.血必凈治療重癥肺炎的臨床研究[J].中國醫藥指南，2010，8（33）：86-87.

[5] 徐藝.血必凈在重癥肺炎治療中的效果觀察[J].中國當代醫藥，2011，18（25）：50-51.

[6] 劉清泉，梁騰宵，劉紅旭，等.血必凈注射液治療膿毒癥的多中心臨床研究[J].北京中醫，2007，26（1）：15-18.