奧曲肽與奧美拉唑聯合應用對肝癌H22生長的抑制作用

李春雷 劉 菁 耿 麗 李 鵬 朱雪松 鄭 芳

湖北醫藥學院附屬東風醫院藥學部，湖北十堰 442008

從1889年Stephen Paget提出腫瘤微環境的 “種子與土壤”假說至今，研究者認識到腫瘤微環境對于腫瘤的增殖、侵襲、遷移、黏附能力及新生血管的形成具有重要影響[1]，也影響腫瘤細胞對放療、化療的敏感性，其中異常的細胞外酸性微環境的誘導和維持，被認為是腫瘤形成和進展的關鍵環節之一[2]。奧美拉唑能夠通過作用質子泵改變腫瘤細胞的酸環境產生抗腫瘤作用[3]。生長抑素類似物奧曲肽和其受體作用發揮抗腫瘤作用，特別是具有很強的腫瘤新生血管生成抑制作用，影響腫瘤組織供血，并且具有逆轉腫瘤耐藥的作用。而且，奧曲肽和奧美拉唑是臨床腫瘤放化療中常用的治療和預防性藥物，兩者作用機制不同，都可以影響腫瘤組織微環境的變化，聯合用藥是否具有增強抗腫瘤作用呢？因此，本研究擬聯合奧曲肽和奧美拉唑共同作用小鼠肝癌H22，初步研究聯合用藥的抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

奧曲肽（0.1 mg/支，諾華制藥），注射用奧美拉唑鈉（40 mg/支，阿斯利康制藥有限公司），順鉑（DDP）注射液（10 mg/支，齊魯制藥），所有抗體、二抗及顯色試劑盒購自武漢博士德試劑公司，其他試劑為分析純。

1.2 實驗動物與瘤株

SPF 級 ICR 雌性小鼠，體質量（20.0±2.0）g，昆明醫學院動物實驗中心提供，合格證號：滇實動證字第SCXK（滇）2005-008，室溫條件下小鼠分籠飼養，自由飲水攝食，過夜；小鼠肝癌H22，本院肝病研究中心提供。

1.3 奧曲肽和奧美拉唑對肝癌H22 腫瘤生長的影響

小鼠肝癌H22 瘤株，腹腔傳代接種。待腹水生長旺盛時，抽出腹水，細胞計數，用生理鹽水調整細胞濃度為5.0 ×106個/mL，于小鼠腋下皮下注射肝癌H22 肉瘤細胞懸液0.2mL/只，接種24 h后隨機分組給藥。根據小鼠體質量隨機分為五組：陰性對照組、順鉑組、奧曲肽組、奧美拉唑組和奧曲肽+奧美拉唑組（聯合用藥組），每組10只，給藥同時觀察小鼠的精神、皮毛光澤度、飲食和活動等一般情況。陰性對照組腹腔注射生理鹽水，其他組分別腹腔注射順鉑1mg/kg、奧曲肽100μg/kg、奧美拉唑100mg/kg，奧曲肽100 μg/kg聯合奧美拉唑100mg/kg，給藥1次/d，連續用藥9 d，末次給藥次日處死小鼠，剝瘤體，稱重計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（陰性對照組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量）/陰性對照組平均瘤質量×100%，并通過抑瘤率比較聯合用藥的療效。

1.4 免疫組織化學法測量微血管密度

各組小鼠瘤體剝離后，參照試劑盒說明書采用免疫組化SABC法染色血管。切取標本，固定，包埋，切片，經染色后，內皮細胞褐染，血管呈黃褐色。采用Weidner[4]的方法及判斷標準進行，計算腫瘤內著色的毛細血管和微小血管，即在低倍視野下選取腫瘤微血管最豐富的區域，然后在400 倍視野范圍 （0.72 mm2）為標準計數被染色的微血管數目，取3個數值的平均值作為微血管密度（micro vessel density，MVD）值。

1.5 統計學方法

應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料采用 χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 奧曲肽和奧美拉唑對肝癌H22 肉瘤生長的影響

小鼠接種腫瘤細胞前2 d活動飲食無異常，第3 天腋下可觸及黃豆大小移植瘤，實驗過程中陰性對照組腫瘤生長明顯快于其他給藥組，且小鼠飲食急劇減少，毛發雜亂無光澤，豎毛現象明顯，蜷縮多活動減少。順鉑組表現出明顯的化療副作用，毛發雜亂無光澤，體質生長緩慢瘦小。隨著腫瘤的生長和藥物的作用，其他組小鼠食欲下降程度、活動減少、體質虛弱、精神不振等表現也不同，同時毛發光澤度出現差異化，實驗完畢各組小鼠體質量的變化也不同。實驗完畢，陰性對照組小鼠腫瘤平均重量＞1 g，說明本實驗小鼠肝癌H22 腫瘤模型移植成功。奧曲肽組、奧美拉唑組、聯合用藥組的瘤重與陰性對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），聯合用藥組的抑瘤率大于單獨用藥的抑瘤率，初步表明兩藥聯合用藥可以增強抗腫瘤效果。見表1。

表1 奧曲肽和奧美拉唑對肝癌H22肉瘤生長的影響（±s，n=10）

表1 奧曲肽和奧美拉唑對肝癌H22肉瘤生長的影響（±s，n=10）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05；“-”表示無數據

組別 前體質量（g） 后體質量（g） 瘤重（g） 抑瘤率（%）陰性對照組順鉑組奧曲肽組奧美拉唑組聯合用藥組19.18±1.63 18.86±0.93 19.03±1.09 18.67±1.1518.19±0.66 28.31±1.96 21.01±1.36 27.27±2.02 26.82±2.03 26.25±1.40 1.79±0.10 0.71±0.12*1.19±0.13*1.26±0.21*1.13±0.07*-60.2 33.529.6 37.1

2.2 奧曲肽和奧美拉唑對肝癌H22 組織微血管密度的影響

小鼠肝癌H22 瘤體經免疫組化染色后，血管內皮細胞被褐染，微血管的大小、形態差異較大，有的僅為單個內皮細胞和內皮細胞族，微血管管腔形態不規則，特別是腫瘤組織出現壞死的邊緣的MVD高于中央。陰性對照組可見微血管廣泛分布于腫瘤組織間質內，其他給藥組微血管明顯減少，減少程度不一，與陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 奧曲肽和奧美拉唑對肝癌H22組織微血管密度的影響（±s，n=10）

表2 奧曲肽和奧美拉唑對肝癌H22組織微血管密度的影響（±s，n=10）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05

組別微血管密度陰性對照組順鉑組奧曲肽組奧美拉唑組聯合用藥組55.42±10.3536.01±6.73*29.34±8.78*40.95±9.23*23.89±5.76*

3 討論

在臨床腫瘤放化療過程中，質子泵抑制劑奧美拉唑常被用來抑酸護胃、止吐等預防不良反應的發生，其潛在的抗腫瘤作用很少引起重視。在體外，奧美拉唑能夠通過不同途徑誘導不同的腫瘤細胞凋亡[5]，還可以作用于腫瘤細胞V型ATP酶來改變腫瘤的微酸環境產生抗腫瘤作用[3]，而且臨床研究資料顯示奧美拉唑可以誘導胃癌前病變組織細胞凋亡[6]，間接提示質子泵抑制劑在腫瘤的放化療中具有非常大的輔助治療價值。同樣，生長抑素類似物奧曲肽主要用于消化道系統疾病治療，輔助用于腫瘤治療，并且臨床研究也報道了生長抑素及其類似物能夠影響胃癌血管的生成[7]，胃癌組織中生長抑素及其受體的表達與胃癌的發生、發展及預后存在密切關系，生長抑素及其類似物對胃癌有抗增殖、促凋亡及抗血管增生等作用[8]。因此，本研究采用奧曲肽和奧美拉唑單獨和聯合用藥作用小鼠抑制瘤模型，初步觀察抗腫瘤效果。

實驗小鼠接種肝癌H22 成功后，各組小鼠的一般情況變化具有很大差異，包括飲食、活動、精神和毛發光澤度等。陰性對照組呈現出典型的癌性惡病質癥狀，順鉑組呈現出典型的化療損傷，而奧美拉唑組和奧曲肽組小鼠在飲食、活動和毛發光澤度好于陰性對照組和順鉑組小鼠，這種差異性暗示奧美拉唑和奧曲肽對荷瘤小鼠的機體具有一定的保護作用，能夠改善腫瘤導致的小鼠癌性惡病質的作用，與沈永華等[9]的研究報道相一致，該作用在臨床腫瘤綜合治療中具有非常大的潛在輔助治療價值。

奧曲肽、奧美拉唑單用和聯用時對肝癌H22的抑制率分別為33.5%、29.6%、37.1%，聯合用藥的抑制率高于單獨用藥者，兩者比較差異無統計學意義。同時，單獨用藥和聯合用藥對腫瘤微血管密度的影響也不同，聯合用藥組微血管密度低于單獨用藥組，兩者比較差異也無統計學意義。無論單用還是聯合用藥，奧曲肽和奧美拉唑均表現出一定的抗腫瘤作用，聯合用藥的作用效果優于單獨用藥，但是沒有統計學差異，分析這種差異可能受給藥劑量、給藥時機等因素的影響較大，假如間歇給藥或者提前預防給藥是否具有更強的抗腫瘤活性。同時，在對腫瘤血管密度影響方面，聯合用藥對腫瘤血管密度的抑制作用大于單獨用藥，也表現出協同效應，與抑瘤率的作用效果一致，但是組間比較沒有差異性，分析原因可能與劑量、給藥時機有關，但是結果間接提示有必要深入研究聯合用藥對腫瘤血管的生長抑制作用。

綜上所述，奧曲肽和奧美拉唑聯合用藥初步顯示出增強抗腫瘤效果，該增強機制、對臨床放化療的減毒增效作用亟需深入的研究，以便更好地應用于臨床腫瘤的輔助治療。

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