松茸乙醇提取物對小鼠S180肉瘤生長的抑制作用

劉 剛 王 輝 張 洪 周本宏

武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢 430060

松茸（Tricholoma matsutake）亦稱松蕈、合菌、松蘑（朝鮮族）、松口蘑等，是擔(dān)子菌綱傘菌目口蘑科（Tricholomataceae）口蘑屬（Tricholoma）的一種與松樹共生外生菌根真菌。在我國東北地區(qū)的吉林省以及西南地區(qū)的云南、四川、西藏都有分布。松茸菌肉肥厚，香氣宜人，味道鮮美，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，曾被譽為“食用菌之王”[1-3]。松茸具有很高的藥用價值及多種生物活性。據(jù)文獻報道，松茸具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗真菌、抗糖尿病、抗炎等功效[4]，在27 種擔(dān)子菌抗腫瘤食用菌中，其抗腫瘤活性居第2 位[5]。

松茸作為一種具有顯著抗腫瘤活性的食用菌，具有廣闊的開發(fā)前景，據(jù)文獻報道松茸中具有抗腫瘤活性的成分主要是多糖類化合物[5-7]，課題組對松茸抗腫瘤活性部位進行研究的過程中，發(fā)現(xiàn)醇提部位MTX也能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同樣具有較強的抗腫瘤活性，其活性成分及作用機制值得深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠肉瘤S180 腹水型腫瘤細(xì)胞由武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供；環(huán)磷酰胺粉針（200 mg/支，批號：10102122），由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)；昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g，購自武漢大學(xué)動物中心，合格證號：4200592711。

1.2 方法[8-9]

1.2.1 松茸乙醇提取物的制備 取松茸約5kg，適當(dāng)粉碎，分次置5000 mL圓底燒瓶中，用10 倍量95%乙醇回流提取3次，每次分別為3、2、2 h，紗布過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，繼續(xù)濃縮，得松茸乙醇提取物浸膏約100.82 g。

1.2.2 小鼠移植瘤模型的建立 將S180 小鼠腹水型腫瘤細(xì)胞株接種于腹腔，于7 d后脫頸椎處死，用75%乙醇浸泡消毒，無菌抽取腹水瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.3 ×107/mL，將0.2 mL細(xì)胞懸液無菌皮下接種于昆明種小鼠左后肢，觀察小鼠生長情況，在接種后第6 天全部出現(xiàn)瘤塊，小鼠移植瘤模型建立成功。

1.2.3 實驗動物分組及給藥 將小鼠隨機分為5 組，每組10只，即腫瘤模型組、陽性對照組及松茸乙醇提取物大、中、小劑量組。腫瘤模型組按劑量10 mL/kg灌胃給予0.5%CMC，陽性對照組按劑量50 mg/kg灌胃給予環(huán)磷酰胺，松茸乙醇提取物大、中、小劑量組以1 000、500、250 mg/kg的劑量灌胃給予松茸乙醇提取物；每日1次，連續(xù)10 d，實驗過程中讓小鼠自由進食和飲水，第11 天停藥。

1.3 觀察指標(biāo)

將小鼠稱取體重后脫頸處死，分離腫瘤塊、脾臟和胸腺組織，稱取腫瘤重量，分別計算各組小鼠體重變化平均值、脾臟及胸腺質(zhì)量分?jǐn)?shù)、腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。各組腫瘤組織標(biāo)本按照常規(guī)方法固定，包埋和切片，HE染色進行觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物的生長情況

昆明小鼠接種S180 后，從生長情況來看，腫瘤模型組小鼠精神狀態(tài)較差，進食量顯著減少，行動呆滯，皮毛無光澤。而陽性對照組及松茸乙醇提取物給藥組的小鼠，其進食量及運動狀態(tài)均好于腫瘤模型組，皮毛順滑。給藥前后各組小鼠體重變化見表1。由表1 可見松茸乙醇提取物大、中、小劑量組及陽性對照組小鼠體重與腫瘤模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均 P>0.05）。

表1 松茸乙醇提取物對S180小鼠體重的影響（±s，g，n=10）

表1 松茸乙醇提取物對S180小鼠體重的影響（±s，g，n=10）

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2.2 對免疫器官質(zhì)量的影響

實驗對動物脾臟質(zhì)量分?jǐn)?shù)和胸腺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響結(jié)果見表2。由表2 可知，陽性對照組與腫瘤模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），松茸乙醇提取物各劑量組與腫瘤模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。

表2 松茸乙醇提取物對S180小鼠免疫器官質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響（±s，n=10）

表2 松茸乙醇提取物對S180小鼠免疫器官質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響（±s，n=10）

注：與腫瘤模型組比較，*P<0.05

組別 給藥劑量（mg/kg）脾臟質(zhì)量分?jǐn)?shù)（×10-3）胸腺質(zhì)量分?jǐn)?shù)（×10-3）腫瘤模型組陽性對照組松茸乙醇提取物大劑量組中劑量組小劑量組20 mL/kg 50 5.86±2.31 3.59±1.40*2.03±0.70 1.21±0.19*1 000 500 250 6.02±1.655.98±1.86 6.15±1.79 2.65±0.86 2.47±0.67 2.55±0.77

2.3 對小鼠S180 肉瘤的生長抑制作用

松茸乙醇提取物大、中劑量組小鼠瘤重與腫瘤模型組比較顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），且腫瘤抑制率均高于30%。松茸乙醇提取物小劑量組小鼠瘤重與腫瘤模型組比較有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；各劑量組對小鼠S180 肉瘤生長的抑制作用見表3。

2.4 小鼠S180 肉瘤組織病理學(xué)觀察

肉瘤組織經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察，腫瘤模型組腫瘤細(xì)胞生長旺盛，侵犯深層肌肉組織，大量新生血管形成，腫瘤細(xì)胞大小不一，細(xì)胞核有較為明顯的異型性，可見瘤組織呈片狀或巢狀生長，無明顯壞死，并可觀察到癌巢之間微血管較為豐富，周圍有不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤；陽性對照組有明顯的腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)域，瘤組織呈團狀或片狀生長，癌細(xì)胞核漿比例較腫瘤模型組小，染色較淺，核型較規(guī)整，可見不同程度的片狀壞死區(qū)及大量核碎裂，伴白細(xì)胞浸潤；松茸乙醇提取物大劑量組可見部分片狀壞死區(qū)域，且瘤組織內(nèi)微血管減少，周圍有不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

表3 松茸乙醇提取物對小鼠S180肉瘤生長的抑制作用（n=10）

3 討論

目前臨床常用的腫瘤放化療藥物大多具有毒副作用，對人體正常細(xì)胞損害較大，因此進一步開發(fā)安全、低毒、有效的抗腫瘤藥物一直是國內(nèi)外學(xué)者研究熱點之一。松茸作為一種藥食兩用菌，其抗腫瘤活性已經(jīng)成為國內(nèi)外研究熱點，據(jù)文獻報道，其抗腫瘤活性部位多為多糖類成分，但本課題組在研究過程中發(fā)現(xiàn)其醇提物同樣具有抗腫瘤活性，且其在動物整體抗腫瘤方面的研究少見報道，因此，松茸醇提部位的抗腫瘤作用及其機制值得深入研究。

人體腫瘤裸鼠移植模型對抗腫瘤藥的反應(yīng)，對臨床療效有預(yù)告價值。因此本實驗通過觀察松茸醇提部位對昆明小鼠S180 肉瘤的抑制作用，研究松茸提取物的抗腫瘤活性。研究結(jié)果表明，松茸乙醇提取物大、中劑量組對小鼠S180 肉瘤的抑制率均高于30%，與腫瘤模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但作用不及環(huán)磷酰胺，提示松茸乙醇提取物中含有抗腫瘤活性成分。此外，松茸乙醇提取物大、中、小劑量組對小鼠脾臟質(zhì)量分?jǐn)?shù)、胸腺質(zhì)量分?jǐn)?shù)及體重的影響與腫瘤模型組比較關(guān)異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明松茸乙醇提取物對小鼠免疫系統(tǒng)幾乎沒有影響。

總之，松茸作為一種具有顯著抗腫瘤活性的食用菌，其抑制腫瘤作用機制及有效成分值得進一步深入研究。

[1] 劉萍，陶文沂，尹光耀，等.松口蘑及其活性物質(zhì)研究進展[J].食用菌報，2001，8（4）：54-58.

[2] 劉剛，王輝，周本宏.云南產(chǎn)松茸17 種氨基酸的含量測定及評價[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（7）：552-554.

[3] Liu G，Wang H，Zhou BH，et al.Compositional analysis and nutritional studies of Tricholoma matsutake collected from Southwest China [J].J Med Plants Res，2010，4（12）：1222-1227.

[4] Tidke G，Rai M.Biotechnological potential of mushrooms：drugs and dye production[J].Int J Med Mushrooms，2006，8（4）：351-360.

[5] Kim J，Byeon S，Lee Y，et al.Immunostimulatory activities of polysaccharides from liquid culture of pine-mushroom Tricholoma matsutake [J].J Microbiol Biotechnol，2008，18（1）：95-103.

[6] 王輝，劉剛，周本宏，等.松茸多糖對K562 細(xì)胞抗腫瘤作用的實驗研究[J].中國藥師，2007，10（12）：1180-1181.

[7] Hoshi H，Yagi Y，Lijima H，et al.Isolation and characterization of a novel immunomodulatory α-glucan-protein complex from the mycelium of Tricholoma matsutake in basidiomycetes [J].J Agric Food Chem，2005，53：8948-8956.

[8] Wan C，Xu H，Xue F，et al.Anti-tumor effects of a refined glycoprotein isolated from Tricholoma matsutake mycelium on sarcoma 180 in mice[J].Chin Pharm Bull，2003，19（12）：1439-1440.

[9] 仇永鑫，樸惠順.小葉錦雞兒二氯甲烷萃取物對小鼠S180 肉瘤生長的抑制作用[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報，2010，33（4）：253-255.