發酵條件對香腸中亞硝酸鹽和亞硝胺的影響*

許偉，徐為民，郇延軍

1(江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京，210014)

2(江南大學食品學院，江蘇 無 錫，214122)

發酵條件對香腸中亞硝酸鹽和亞硝胺的影響*

許偉1，2，徐為民1，郇延軍2

1(江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京，210014)

2(江南大學食品學院，江蘇 無 錫，214122)

以發酵香腸為對象，研究了不同亞硝酸鹽添加量以及發酵條件下亞硝酸鹽殘留和二乙基亞硝胺(NDEA)的變化規律。結果表明:各因素對香腸中亞硝酸鹽殘留和NDEA形成影響的大小順序為，發酵時間＞亞硝酸鹽添加＞發酵溫度＞發酵劑。正交實驗分析表明:最佳發酵條件為，發酵時間2 d、亞硝酸鹽添加量50 mg/kg、發酵溫度25℃。

發酵香腸，發酵，亞硝酸鹽，亞硝胺

亞硝酸鹽是發酵腸制品中常用的食品添加劑，具有發色、抑菌及防腐、抗氧化等多種功能[1］。但研究表明，當一次性攝入過多的亞硝酸鹽時，會引起人體的急性中毒反應;此外，亞硝酸鹽還能與食品中存在的胺類物質發生亞硝基化反應生成強致癌物質亞硝胺[2］，從而引發一系列食品安全問題。因此在還未找到能完全替代亞硝酸鹽物質的前提下，研究亞硝酸鹽殘留以及亞硝胺形成的變化規律就成為了重點。孫敬等[3-5］從熱處理、貯藏的角度研究了肉糜中亞硝酸鹽和亞硝胺的變化規律;Rywotycki等[6-7］則研究了原料肉對亞硝胺的影響;此外，Sung[8］還綜述了諸如煙熏、燒烤、油炸等不同的烹飪方式對食品中亞硝胺變化的影響。這些研究從不同的角度探究了各種因素對亞硝酸鹽殘留和亞硝胺形成的影響，然而關于發酵條件的不同對發酵肉制品中亞硝酸鹽和亞硝胺變化規律影響的研究還鮮有涉及。因此，本研究以發酵香腸為對象，研究了不同亞硝酸鹽添加量和發酵條件下香腸中亞硝酸鹽殘留和亞硝胺形成的變化規律，并深入分析引起這些變化的原因，從而為掌握發酵肉制品中亞硝酸鹽和亞硝胺的變化規律提供理論支撐，并對發酵香腸加工工藝的確定提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

菌種:木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)，均購自廣州微生物研究所。

原料:新鮮豬后腿肉購自超市，并于4℃下冰箱貯藏。

試劑:二乙基亞硝胺(NDEA)，Sigma公司，色譜純;二氯甲烷(應用全玻璃儀器重蒸);其余試劑皆為分析純。

BS223S型電子天平，上海電子天平廠;CM-14型斬拌機，西班牙MAINCA公司;ZDX-35BI型殺菌鍋，上海申安醫療器械廠;恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司;電子調溫電熱套，江蘇常州市金壇榮華儀器制造有限公司;ZX98-1型旋轉蒸發儀，上海魯伊工貿有限公司;微量進樣器(50 μL)，無錫市東升玻璃儀器廠;UV2600型分光光度計，上海天美生化儀器設備工程有限公司;氣相色譜-質譜聯用儀，美國瓦里安公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵香腸加工工藝流程

原料肉修整(肥瘦質量比2∶8)→切丁→拌餡(加入輔料:食鹽、白糖、白酒、亞硝酸鹽、五香粉、胡椒粉、味精、淀粉)→腌制→斬拌(加入發酵劑:木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌)→填充→發酵(37℃，48 h)→成熟(65～80℃至表皮干燥呈深紅色)→蒸煮(121℃，30 min)→成品

1.2.2 檢測方法

亞硝酸鹽:GB/T 5009.33-2003鹽酸萘乙二胺法[9］;亞硝胺:GB/T 5009.26-2003第二法氣相色譜-質譜儀法[10］。

1.2.3 實驗設計

考察發酵溫度、時間、菌種比例(木糖葡萄球菌接種量:肉葡萄球菌接種量)以及亞硝酸鹽添加量4個因素對亞硝酸鹽和亞硝胺的影響，分為兩部分進行:

首先單獨考察各因素對亞硝酸鹽和亞硝胺的影響，設計為單因素實驗，原發酵條件為:溫度37℃，亞硝酸鹽添加量150 mg/kg，發酵時間2 d，菌種比例(木糖葡萄球菌接種量比例肉葡萄球菌接種量=1∶1)。各水平選取如表1所示。

表1 因素水平表

單因素實驗結束后，按照L9(33)設計正交實驗(表2)，綜合考察各因素對發酵香腸中亞硝酸鹽殘留和亞硝胺形成的影響。

表2 正交實驗方案

2 結果與分析

2.1 發酵條件對香腸中亞硝酸鹽和亞硝胺的影響

由圖1可以得出:

(1)低溫發酵能促進亞硝酸鹽的分解和降低NDEA的形成。關于這點可以從溫度對微生物影響的角度進行分析。研究表明某些微生物能促進酶催化的亞硝基化反應[11］，因此本研究認為，這些微生物只有在較低的外界環境中才能得到較好的生長，從而在一定程度上促進亞硝胺的形成。此外，低溫也可能有利于能分解亞硝酸鹽微生物的生長，從而促進其殘留量的下降。

(2)發酵時間的延長能促進亞硝酸鹽的分解，這與Marco[12］所得結果一致，這可能是由于亞硝酸鹽的活性較大、容易與其他物質發生反應的結果。另一方面，發酵時間還能促進NDEA的形成，這很有可能是其積累所致。

(3)亞硝酸鹽在酸性條件下所形成的亞硝基NO+是亞硝化反應的重要底物之一，因此亞硝酸鹽作為影響亞硝胺形成的重要因素這一點已得到眾多研究者的認可[13-16］，這在本研究中也得到了證實:圖1-c)明顯的反映出了這一變化趨勢。

圖1 發酵條件對香腸中亞硝酸鹽殘留和NDEA形成的影響

(4)本研究所采用的2菌種對亞硝酸鹽殘留和NDEA的形成沒有明顯的影響。有研究表明，腸菌屬和梭菌屬細菌具有合成亞硝胺的能力，而一些細菌能夠促進亞硝胺的形成;亞硝胺的合成反應中一些霉菌類會具有生物催化活性，主要包括青霉菌和根霉菌屬[17］。因此，本研究所得出的采用木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌(屬于葡萄球菌屬)作發酵劑時對亞硝胺的形成沒有影響這一結論也與上述觀點相符。此外，從圖1-d還可以看出:相較于空白組，2菌種的添加能降低亞硝酸鹽的殘留量、但并不明顯，這與朱志遠[18］所得結果一致。

(5)各因素與亞硝酸鹽殘留和NDEA形成的相關性分析表明，除了亞硝酸鹽添加量，發酵溫度和時間對亞硝酸鹽殘留量的影響皆不顯著(P＞0.05);而發酵溫度和時間以及亞硝酸鹽的添加則均對NDEA的形成有著顯著的影響(P＜0.05)。由此可知，僅憑單因素實驗還不足以區分各發酵條件對亞硝酸鹽和NDEA影響的大小。因此下一階段在選取一定的因素水平后，采用正交實驗的方式來考察發酵溫度、發酵時間和亞硝酸鹽的添加對這兩個變量的影響，以期更準確的把握亞硝酸鹽殘留和NDEA形成的變化趨勢。值得一提的是，由于本研究所采用的兩菌種對亞硝酸鹽殘留和NDEA的形成均沒有明顯的影響，故在正交實驗時將此項排除，不再作為考察因素。

2.2 發酵條件對香腸中亞硝酸鹽和亞硝胺影響的進一步探究

根據前一階段所得實驗結果，各因素水平的選取如表3所示。

表3 因素水平表

對于所得實驗結果，本研究采用方差分析法分析，計算所得結果如表4所示。

表4 正交實驗方案與結果

根據以上計算，進行顯著性檢驗，列出方差分析表，結果見表5。

表5 方差分析表

由表5可知:

(1)所考察的3個因素對亞硝酸鹽殘留和NDEA形成影響的大小順序為，發酵時間＞亞硝酸鹽添加＞發酵溫度。

(2)發酵時間對亞硝酸鹽殘留和亞硝胺形成的影響都很顯著，尤其是對亞硝酸鹽的殘留，較之亞硝酸鹽添加量都明顯，表明發酵時間是影響2個觀測變量的一個重要因素。

(3)發酵溫度對亞硝酸鹽殘留的影響不大，這可能是因為所采用的發酵劑(木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌)屬于過氧化氫酶陽性球菌、能夠將亞硝酸鹽分解成氨[19］，因此在腌制階段接入菌種就已經大量增殖、分解了大量的亞硝酸鹽，從而導致溫度對亞硝酸鹽殘留影響不大。而對亞硝胺的形成，發酵溫度對其影響卻較明顯，表明低溫有利于對亞硝胺的形成起影響作用的微生物的增殖。

(4)亞硝酸鹽的添加與亞硝胺的形成呈顯著正相關，與其殘留有一定的相關性、但并不顯著。理論上認為，亞硝酸鹽的殘留應該與其添加量呈現出較明顯的相關性，而本研究結果卻表明，兩者之間的相關性不顯著。關于這一點，本研究認為可以從圖2所示來解釋——接入發酵劑時，在發酵初期由于只有這兩種接入菌種在大量增殖、在其作用下將大量的亞硝酸鹽分解、從而導致其殘留量增多的幅度不大(F=6.12);然而隨著發酵時間的延長(＞2d)、乳酸菌等微生物的增殖會對這兩種微生物產生抑制作用[20］，使得亞硝酸鹽沒有繼續被大量的降解、保留了一定的量，從而對亞硝胺的形成沒有造成明顯的阻礙作用，使得亞硝酸鹽添加與亞硝胺形成的相關性顯著。

(5)本實驗中亞硝酸鹽殘留量和亞硝胺的形成量皆越低越好。因此綜合考慮，發酵時間選擇2 d、亞硝酸鹽添加量取50 mg/kg、發酵溫度選25℃，即優化組合為A2B1C1。當采用此優化最佳發酵條件作試驗驗證時:對于亞硝酸鹽殘留量，優化組合A2B1C1平均值為2.456 mg/kg，低于組合A3B3C1的2.578 mg/kg;對于NDEA形成量，優化組合A2B1C1中NDEA均未檢出。由此可知:本研究結果與客觀事實較符合，滿足分析要求。

圖2 發酵香腸中微生物的生長(示意圖)

3 結論

(1)發酵條件對香腸中亞硝酸鹽殘留和NDEA形成影響的大小順序為:發酵時間＞亞硝酸鹽添加＞發酵溫度＞發酵劑(木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌)。這其中:發酵時間是影響亞硝酸鹽殘留和NDEA形成的重要因素;亞硝酸鹽的添加對NDEA形成的影響也很明顯;發酵溫度則對NDEA形成的影響較大，對亞硝酸鹽殘留卻沒有明顯的影響;至于本研究所采用的發酵劑，則對兩者沒有明顯的影響。

(2)本研究所得出的發酵時間2 d、亞硝酸鹽添加量50 mg/kg、發酵溫度25℃這一優化組合，能有效的降低亞硝酸鹽的殘留量和抑制NDEA的形成。

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ABSTRACTThe effect of the amount of sodium and fermented conditions on changes of sodium nitrite residues and N-diethylnitrosamine(NDEA)in fermented sausages were studied.The results showed that the effect order of the observed factors on the nitrite residues and the formation of NDEA in fermented sausages were as follows:fermentation time＞addition of nitrite＞fermentation temperature＞starter culture.The optimum fermented conditions fixed by orthogonal experiment were:the fermentation time 2d，the addition of nitrite 50mg/kg and the fermentation temperature 25℃，respectively.

Key wordsfermented sausages，fermentation，nitrite，N-nitrosamine

Effects of Fermented Conditions on Changes of Nitrite and N-nitrosamine in Fermented Sausages

Xu Wei1，2，Xu Wei-min1，Huan Yan-jun2
1(Institute of Agricultural Products Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Science，Nanjing 210014，China)
2(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(徐為民為通訊作者)。

*江蘇省農業科技自主創新資金項目(江蘇省農業三項工程項目)

2012-04-01，改回日期:2012-06-05