黏質沙雷氏菌胞外幾丁質酶的純化及特性

施騰鑫，黃秀菁，劉嘉，賀淹才

1(福建福大百特科技發展有限公司酶高效表達國家工程實驗室，福建福州，350000)

2(華僑大學工業生物技術研究所，福建泉州，362021)

黏質沙雷氏菌胞外幾丁質酶的純化及特性

施騰鑫1，黃秀菁1，劉嘉2，賀淹才2

1(福建福大百特科技發展有限公司酶高效表達國家工程實驗室，福建福州，350000)

2(華僑大學工業生物技術研究所，福建泉州，362021)

黏質沙雷氏菌幾丁質酶發酵上清液經硫酸銨沉淀、透析、DEAE-瓊脂糖凝膠陰離子交換層析和苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析，得到電泳純的幾丁質酶和幾丁質結合蛋白CBP21。該幾丁質酶和CBP21分子質量分別約為58 ku和21 ku，CBP21對該幾丁質酶水解幾丁質增效明顯。幾丁質酶反應最適溫度為50℃，最適pH約為6.5～7.0。該酶在55℃以下、pH 4.5～8.0范圍內穩定。酶的Km值為0.22 mg/mL，Vm為1.26 μmol/(min·mg)。金屬離子K+、Sn2+、Mn2+對酶有一定激活作用，而Pb2+、Hg2+和Cu2+則強烈抑制其活性。該幾丁質酶的糖基含量約為3.3%。EDTA和2-ME可分別提高酶活力65%和105%。H2O2強烈抑制酶活力，提示其活性中心可能存在硫氫基。

黏質沙雷氏菌，幾丁質酶，純化，特性

幾丁質(又稱甲殼素)是N-乙酰-D-葡萄糖胺以2-1，4糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物，是自然界中含量僅次于纖維素的可再生資源[1］。幾丁質酶(Chitinase，EC3.4.1.14)分布廣泛，幾乎從微生物到高等動植物所有的生物類群中都有分布[2］，其中產幾丁質酶的微生物種類涵蓋了細菌、放線菌和霉菌。但目前對幾丁質純品酶的研究報道尚少，已報道的得到純化的胞外幾丁質酶有綠色木霉、鏈霉菌、球孢白僵菌、產氣腸桿菌、黃桿菌等[3-7］，而且幾乎所有對幾丁質酶的純化及特性的研究均集中于單酶，而未對酶或蛋白間的協同作用加以研究分析。在實際工業應用中，很多酶在降解底物上的協同作用極為明顯，如纖維素酶[8］、阿魏酸酯酶[9］等，而針對幾丁質酶在這方面的報道卻較為罕見。因此本研究對1株黏質沙雷氏菌所產的胞外幾丁質酶進行純化，得到電泳純幾丁質酶和幾丁質結合蛋白(CBP21)，初步對該幾丁質酶和CBP21的協同作用進行了研究，并對該幾丁質酶的一系列特性進行分析探討，對了解其結構和功能具有積極意義，為后續工作打下基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)分離自海灘土壤，本實驗室保存。

1.2 SMCS 培 養基[10］

K2HPO4700 mg，KH2PO4300 mg，NaCl 300 mg，MgSO4·7H2O 500 mg，CaCl2300 mg，ZnSO410 mg，CoCl210 mg，FeSO4·7H2O 10 mg，膠體幾丁質10 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0～7.1。每250 mL三角瓶裝量50 mL，8層紗布扎口。

1.3 主要試劑及儀器

幾丁質、考馬斯亮藍R250、SDS、Glycin和TEMED等購自Sigma公司;低分子量標準蛋白為Takara公司產品;EDTA(乙二胺四乙酸)、DEPC(二乙基焦碳酸鹽)、PMSF(苯甲基磺酰氟)、乙二醛(Glyoxal)、Ch-T(氯胺-T)、2-ME(β-巰基乙醇)均購自Sigma公司;其余試劑均為國產分析純。

AKTA快速液相層析儀，GE;DEAE-Sepharose FF和Phenyl-Sepharose FF，Pharmacia;垂直板狀電泳槽，Bio-Rad;高速冷凍離心機，Sigma;凝膠成像系統，上海天呈科技有限公司。

1.5 分析方法

1.5.1 幾丁質酶活力測定

參照Nawani法[11］，0.5 mL膠體幾丁質與適當稀釋的酶液0.5 mL于50℃水浴振蕩反應1 h，用DNS法[12］測定。酶活力單位(U)定義為:在50℃下每分鐘釋放出相當于1 μmol N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的還原糖所需要的酶量。

1.5.2 蛋白質含量測定

采用改進的Bradford法[13］。取100 μL樣品液，加入5 mL考馬斯亮藍，30℃靜置20 min后，于590nm和450 nm處分別測定吸光度值，以OD590/OD450為縱坐標，以標準蛋白濃度為橫坐標。

1.5.3 電泳

采用垂直板狀電泳，SDS-PAGE按標準方法進行[14］。

1.6 純化步驟

分離純化過程所用緩沖液均為pH 7.0、0.02 mol/L的Tris-HCl緩沖液;冷凍離心條件均為4℃，8000 r/min，15 min。

1.6.1 硫酸銨鹽析

將培養液于冷凍離心，所得上清液即為粗酶液。70%飽和度硫酸銨沉淀，4℃靜置過夜。冷凍離心棄上清，沉淀溶解于緩沖液中，100倍體積于相同體系中透析48 h除鹽，每12 h更換1次緩沖液。

1.6.2 DEAE瓊脂糖凝膠陰離子交換層析

離子交換柱為DEAE-瓊脂糖凝膠柱(1 mL)。將上清液加到瓊脂糖凝膠離子交換柱，用含有0～0.5 mol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫(pH7.2，流速1 mL/min)。

1.6.3 苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析

疏水層析柱為苯基-瓊脂糖凝膠柱(1 mL)。將活力組分冷凍干燥濃縮后，加硫酸銨至終濃度為1mol/L上苯基-瓊脂糖凝膠疏水柱，用不含硫酸銨和含1 mol/L硫酸銨的緩沖液進行梯度洗脫(流速1 mL/min)。

1.7 酶學特性

1.7.1 表觀相對分子量的測定

SDS-PAGE法測定相對分子量。

1.7.2 幾丁質酶與幾丁質結合蛋白的協同性

將純化得到的幾丁質酶與CBP21以一定比例混合，按標準方法測定酶活力。以不含CBP21的酶液作為對照，研究幾丁質酶和CBP21對底物作用的協同性。

1.7.3 最適反應溫度及熱穩定性

在不同溫度下按照標準方法測定酶活，以酶活最高者為100%。酶液在30～80℃下保溫不同時間后，按標準方法測殘余酶相對活力，以未保溫的酶液的酶活力為100%。

1.7.4 酶的最適反應pH及酸堿穩定性

將酶液分別加在pH3.0～10.0的緩沖液中，按標準方法測定酶活力，以酶活最高者為100%。將酶液用不同pH的緩沖液稀釋，50℃保溫1 h后，測殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力100%。

1.7.5 動力學參數測定

將酶液與不同濃度的幾丁質反應后測定其酶活力。用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法求出該酶的Km及Vm值[12］。

1.7.6 金屬離子對酶活力的影響

用0.1mol/L的 Na2HPO4-檸 檬 酸 緩 沖 液(pH6.5)配制含5 mmol/L的金屬離子緩沖液，與0.5 mL酶液50℃和1%膠體幾丁質混勻，50℃反應1h后測定幾丁質酶活力，以不含金屬離子的反應液為對照。

1.7.7 底物特異性

在反應體系中以不同底物進行幾丁質酶的酶解反應，按標準方法測定酶活力。

1.7.8 修飾實驗

加入不同濃度的蛋白修飾劑于酶液中，調整至所需的終濃度，按標準方法測定酶活力。

1.7.9 糖基含量測定

采用乙酸乙酯-蒽酮-濃硫酸法[15-16］測定。利用由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖等10種糖配制成混合糖溶液獲得標準曲線。將酶液按要求加入一定量的乙酸乙酯-蒽酮混合液及濃硫酸，室溫反應30 min后于620 nm比色測定，結合糖基含量標準曲線進行計算得出糖基含量(w/w)。

2 結果與分析

2.1 幾丁質酶的分離純化

2.1.1 DEAE-瓊脂糖凝膠陰離子交換層析

黏質沙雷氏菌在SMCS培養基中振蕩培養3天后，發酵液冷凍離心后通過硫酸銨沉淀、透析及DEAE瓊脂糖凝膠離子交換層析，得到圖1。有3個吸收峰，峰1的幾丁質酶活力高蛋白集中，收集峰1處的活性組分進行電泳檢測，發現有2條蛋白帶。將收集到的組分濃縮后上苯基-瓊脂糖凝膠疏水柱。

2.1.2 苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析

經離子交換層析后得到的樣品上疏水柱后，用不含硫酸銨和含1 mol/L硫酸銨的緩沖液進行梯度洗脫，洗脫圖譜見圖2。在純化過程中出現2個蛋白峰。通過酶活力測定，幾丁質酶活力集中在峰2。收集峰2處活性液進行SDS-PAGE檢測。純化結果見表1。

圖2 苯基-瓊脂糖凝膠疏水柱層析圖

2.1.3 酶純度鑒定及實驗結果分析

SDS-PAGE結果如圖3所示，經鹽析、DEAE-瓊脂糖凝膠離子交換層析和苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析后所得的幾丁質酶已達電泳純。該酶分子質量為58 ku。此外，對疏水層析中收集到的峰1的蛋白液進行SDS-PAGE，亦呈單一條帶，分子質量為21 ku。該蛋白無酶活性;將其與膠體幾丁質混合于4℃下靜置1h后離心，得到的上清中幾乎不存在蛋白，表明該蛋白與幾丁質結合力強;將該蛋白與純化的幾丁質酶混合，發現其對酶解幾丁質有增效作用。這些特征與Kazushi等人[17］的研究結果一致。將幾丁質結合蛋白和幾丁質酶根據Brurberg的報道[18］進行對比，該幾丁質酶和幾丁質結合蛋白可能分別為ChiA和CBP21。

圖3 幾丁質酶SDS-PAGE電泳圖譜

2.1.4 純化結果

分別測定純化各步驟的酶活力和蛋白量，求出純化后的比活力、產率以及純化倍數，純化結果詳見表1。發酵液經鹽析、DEAE-瓊脂糖凝膠離子交換層析和苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析后，得到純酶，比活力由粗酶液的43.07 U/mg提高到純酶液的1575.76 U/mg，純化36.6倍，收率8.5%。但在純化過程中，隨著蛋白樣品組分中的抑制成分或促進成分的逐步移除，酶的活力會得到較大的提升或降低。因此對于某些酶樣品，根據比活力來推算純化倍數和收率的方法，只能作為粗略方案[19］。

表1 幾丁質酶純化過程

2.2 酶學特性

2.2.1 幾丁質酶與幾丁質結合蛋白的協同性

將幾丁質酶與CBP21以不同比例混合后測定酶活力，研究二者對底物作用的協同性，結果見圖4。隨著CBP21的濃度的比率的增加，幾丁質酶水解效果顯著增強，相對酶活力最高可達365%。這可能由于CBP21首先與底物結合，從而使底物呈現出易于被幾丁質酶水解的構象[20］，從而提高了酶的水解效率。

圖4 幾丁質酶與CBP21水解膠體幾丁質的協同性

2.2.2 最適反應溫度及溫度穩定性

在不同溫度下測定幾丁質酶活力，并將幾丁質酶分別保溫1 h后，測定殘留酶活力，結果見圖5。在30℃～50℃之間，隨著反應溫度的升高，水解效率顯著增加，50℃為酶反應最佳溫度，55℃時酶活力約下降50%，70℃時酶基本失活。將酶液保溫1h后按標準方法測定酶活力，酶在30～55℃較為穩定，溫度大于55℃時酶活力迅速下降，超過65℃酶基本失活。

2.2.3 最適反應pH及酸堿穩定性

圖5 溫度對幾丁質酶活力的影響及熱穩定性

在不同pH值的緩沖液體系中測定幾丁質酶活力，并將幾丁質酶在不同pH的體系中放置1h后測定酶活力，結果見圖6。pH 4.5～6.5時，相對酶活力在75%以上，pH 6.5左右時酶活力最高。當pH為10.0時，該幾丁質酶活力仍能保持50%以上。在不同pH環境下放置1 h后測定殘余酶活力發現，該酶在pH4.5～8.0，可以保持原來酶活力的50%以上，當pH低于4.5或高于8.0時酶活力迅速喪失。

2.2.4 動力學參數測定

將膠體幾丁質溶于Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(0.02 mol/L，pH 6.5)中，配成0.2～10.0 mg/mL濃度，以相同酶濃度進行反應。由Lineweaver-Burk作圖法計算米氏常數，該酶的Km和Vm值分別為0.22 mg/mL和1.26 μmol/(min·mg)。

圖6 pH對幾丁質酶活力的影響及酸堿穩定性

圖7 黏質沙雷氏菌幾丁質酶的Lineweaver-Burk圖

2.2.5 金屬離子對酶活力影響

在反應體系中加入不同金屬離子，使其終濃度為5 mmol后，按標準方法測定幾丁質酶活力，結果見表2。金屬離子K+、Sn2+、Mn2+對幾丁質酶酶活性有一定激活作用，而Pb2+、Cu2+和Hg2+則強烈抑制該幾丁質酶活性，其中更以Hg2+抑制作用最強。

表2 不同金屬離子對酶活力的影響

2.2.6 幾丁質酶的底物特異性

分別以膠體幾丁質、水溶性殼聚糖、微晶纖維素、羧甲基纖維素和天然蝦殼粉(過60目篩)為底物測定酶活力，底物濃度均為1%，結果如圖8所示。該幾丁質酶對膠體幾丁質具有較高的底物特異性，對天然蝦殼粉的降解能力也較好。此外，該酶還有一定的殼聚糖酶活性。

2.2.7 酶的蛋白修飾

圖8 幾丁質酶的底物特異性

在反應體系中加入一定量的蛋白修飾劑，調整至所需的終濃度(0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.5%，v/v或w/v)，測定幾丁質酶活力，結果如圖9所示。結果表明，在所示的濃度下，DEPC對該幾丁質酶有輕微的激活作用。EDTA和2-ME顯著提高酶活力，最高促進率分別可分別提高65%和105%，表明該酶為非金屬酶，活性中心不存在二硫鍵;PMSF和DEPC對酶活力沒有明顯影響，說明酶的活性中心不存在絲氨酸和組氨酸;H2O2強烈抑制酶活性，此外該酶也被Hg2+強烈抑制，說明該幾丁質酶對氧化劑極為敏感，提示其活性中心可能存在硫氫基;CH-T和乙二醛使酶發生了一定程度的鈍化，可能是由于CHT和乙二醛修飾了該酶活性中心以外的蛋氨酸殘基和精氨酸殘基而間接導致酶的空間構象發生改變。

圖9 不同修飾劑對幾丁質酶活力的影響

2.2.8 糖基含量測定

將純化得到的純酶采用乙酸乙酯-蒽酮-濃硫酸法對糖基含量進行測定，測得糖基含量約為3.3%。多數真菌所產幾丁質酶的糖基含量較高，使得該酶顯著區別于真菌幾丁質酶。

3 結論

幾丁質酶是一類差異較大的水解酶類，一些文獻已報道了不同來源的幾丁質酶的分離純化及性質研究[4-7］。本文在幾丁質酶的相對分子量、反應溫度、耐酸堿性以及金屬離子對酶活力的影響等方面進行了研究，與已報道純化的黏質沙雷氏菌胞外酶[21］相比較差異較為顯著。此外，本文還對幾丁質酶與幾丁質結合蛋白(CBP21)的協同作用、底物特異性、活性中心基團以及糖基含量方面作了研究。結果表明，CBP21對該幾丁質酶有顯著增效作用，可使該酶對底物的催化效率提高365%;該幾丁質酶的糖基含量低，酶活力可被EDTA和2-ME試劑顯著提高等特性使得該酶顯著區別于一些真菌幾丁質酶[22-24］;該幾丁質酶對天然蝦殼粉的作用效果較好，表明該酶在實際應用中有著較好的應用價值。

在純化過程的離子交換步驟中的第2個洗脫峰的蛋白液也存在酶活力。通過SDS-PAGE檢驗，其目的條帶與主峰不同，應屬于不同的幾丁質酶，但由于酶活力低蛋白含量較少，故未予收集。因此，為了研究不同幾丁質酶之間的協同作用，應構建含不同幾丁質酶基因的工程菌以純化出相應的幾丁質酶，研究其對幾丁質的水解機理以及協同增效的最適配比，為提高幾丁質酶的熱穩定性和酸堿穩定性而進行的固定化混合酶研究工作研究奠定基礎。

[1]Berkeley R C W.In Microbial Polysacchardes and Polysaccharases[M］.London，New York and San Francisco:Academic Press，1979:205-236.

[2]Felse P.A，Panda T.Production of microbial chitinases-a revisit[J］.Bioprocess Engineering，2000，23:127-137.

[3]Crispinus A Omumasaba，Naoto Yoshida，Kihachiro Ogawa.Purification and characterization of a chitinase from Trichoderma viride[J］.General and Applied Microbiology，2001，47:53-61.

[4]楊文博，馮波，佟樹敏.鏈霉菌SO1菌株幾丁質酶的純化及性質[J］.微生物學通報，1997，24(2):84-88.

[5]彭仁旺，管考梅，黃秀梨.球孢白僵菌兩種胞外幾丁質酶的誘導和純化[J］.微生物學報，1996，36(2):103-108.

[6]唐亞雄，趙建，丁詩華，等.產氣腸桿菌幾丁質酶的分離純化及性質研究[J］.2000，41(1):82-86.

[7]陳三鳳，李季倫.黃桿菌(Flavobacterium sp.)幾丁質酶的純化和性質[J］.微生物學報，1994，34(1):14-19.

[8]王春卉，汪天虹.纖維素酶分子的纖維素吸附區的研究進展[J］.纖維素科學與技術，1997(4):1-10.

[9]薛楓，歐仕益，汪勇.雙酶法降解細胞壁物質制備低聚木糖和阿魏酸研究進展[J］.糧食與飼料工業，2005(5):28-30.

[10]Di Pietro A，Lorito M，Hayes C K.Endochitinase from Glioclad iumvirens:Isolation，characterization，and synergistic antifungal activity in combination with gliotoxin[J］.Phytopathology，1993，83:308-313.

[11]Nawani N N，Kapadnis B P，Das A D，et al.Purification and characterization of a thermophilic and acidophilic chitinase from Microbispora sp.V2[J］.Journal of Applied Microbiology，2002，93(6):965-975.

[12］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗技術[M］.北京:高等教育出版社，1997:111-116;165-171.

[13]Tsaffrir Zor，Zvi Selinger.Linearization of the Bradford Protein Assay increases its sensitivity:theoretical andexperimental studies[J］.Analytical Biochemistry，1996，236:302-308.

[14］夏其昌.蛋白質化學研究技術與進展[M］.北京:科學出版社，1997:102-107.

[15］張樹政，孟廣震，何忠效.酶學研究技術[M］.北京:科學出版社，1987:86-98.

[16]吳凱，代澤友，馬波，等.改進的蒽酮法檢測肺炎鏈球菌莢膜多糖結合物中多糖濃度[J］.中國生物制品學雜志，2007，20(7):538-549.

[17]Kazushi Suzuki，Taku Uchiyama，Megumi Suzuki，et al.LysR-type Transcriptional Regulator ChiR Is Essential for Production of All Chitinase and a Chitin-Binding Protein，CBP21，in Serratia marcecsens 2170[J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，2001，65(2):338-347.

[18]May Bente Brurberg，Bjornar Synstad，Sonja Sletner Klemsdal，et al.Chitinases from Serratia marcescens[J］.Manuscript Recent Research Developments in Microbiology.2000.12.14.

[19]Richard R.Burgess，Murray P.Deutscher.Guide to Protein Purification(Second Edition)[M］.Beijing:Science Press，2009:10-19.

[20]Kazushi Suzuki，Megumi Suzuki，Mayumi Taiyoji，et al.Chitin Binding Protein(CBP21)in the Culture Supernatant of Serratia marcescens 2170[J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，1998，62(1):128-135.

[21]陳明，孫昌魁，程劍鋒，等.黏質沙雷氏菌L15-2幾丁質酶的分離純化與性質研究[J］.生物加工過程，2006，4(2):15-19.

[22]楊革，陳洪章，李佐虎.綠僵菌幾丁質酶的分離純化及性質[J］.化工學報，2005，56(4):672-676.

[23]Kihachiro Ogawa，Naoto Yoshida，Ryuichiro Ikeda，et al.Purification and characterization of a novel chitinase from Burkholderia cepacia strain KH2 isolated from the bed log of lentinus edodes，shiitake mushroom[J］.The Journal of General and Applied Microbiology，2002，48(1):25-33.

[24]Woo S，Fogliano V，Scala F，Lorito M.Synergism between fungal enzymes and bacterial antibiotics may enhance biocontrol[J］.Antonie van Leeuwenhoek，2002，81(1/4):353-356.

ABSTRACTAn extracellular chitinase and a chitin-binding protein(CBP21)were isolated from the culture of Serratia marcescens and purified to electrophoretic homogeneity by ordinal procedures containing ammonium sulfate precipitation，DEAE-Sepharose and Phenyl-Sepharose chromatography.Their relative molecular masses were estimated to be respectively about 58kD and 21kD by SDS-PAGE.CBP21 had great synergistic effect with the chitinase on chitin hydrolysis.The optimum temperature and pH for the enzyme activity were 50℃and 6.5 respectively.The enzyme activity was stable under 55℃and in the pH range of 4.5～8.0.Michaelis constants of the enzyme were Km 0.22 mg/mL and Vm 1.26 μmol/(min·mg)respectively.The activity was enhanced by K+，Sn2+and Mn2+and was strongly inhibited by Pb2+，Hg2+and Cu2+.EDTA and 2-mercaptoethanol(2-ME)enhanced the activity by 65%and 105%respectively.H2O2strongly inhibited chitinase activity，which indicated that hydrosulfide group was the possible essential residue for enzyme activity.

Key wordsSerratia marcescens，chitinase，purification，characterization

Purification and Characterization of Extracellular Chitinase from Serratia marcescens

Shi Teng-xi1，Huan Xiu-jing1，Liu Jia2，He Yan-cai2
1(National Engineering Laboratory for High Effective Enzyme Express in Fujian Fuda Biotech，Ltd.，Fuzhou 350002，China)
2(Institute of Industrial Biotechnology，Huaqiao University，Quangzhou 362021，China)

碩士，(賀淹才教授為通訊作者)。

2012-03-05，改回日期:2012-05-20