HPLC-梯度洗脫測定保健食品中吡啶甲酸鉻

那海秋，馬殿君，趙飛

（遼寧省食品藥品檢驗所，遼寧沈陽110023）

HPLC-梯度洗脫測定保健食品中吡啶甲酸鉻

那海秋，馬殿君，趙飛

（遼寧省食品藥品檢驗所，遼寧沈陽110023）

建立保健食品中吡啶甲酸鉻成分的檢測方法。高效液相色譜法，三元流動相體系-梯度洗脫，C18反向色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫 25 ℃，檢測波長為 254 nm，流速為 0.5 mL/min，進樣量為 10 μL。吡啶甲酸鉻在 0～92.88 μg/mL之間具有良好的線性關系，相關系數R=0.9997，2個濃度平均加標回收率分別為92.90%、96.19%。本方法對保健食品中吡啶甲酸鉻具有較好的分離效果和精密度，梯度洗脫縮短了樣品檢驗時間，適用于保健食品中吡啶甲酸鉻的定量檢測。

吡啶甲酸鉻；高效液相色譜；梯度洗脫；保健食品

Abstract:To develop a method for determining the content of chromium picolinate in sanitarian food.The HPLC was carried out with C18-BP(5 μm,4.6 mm×250 mm)column set at 25 ℃.The mobile phase was phosphoric acid,methanol and acetonitrile with flow rate of 0.5 mL/min.The detection wavelength was set at 254 nm,and the sample size was 10 μL.The linearity of the method ranged from 0 to 92.88 μg/mL and R=0.9997.The average recovery rate was 92.90%and 96.19%for 2 kinds of concentration.High-performance chromatogrphic method is steady and reliable for detecting the concentration of chromium picolinate and it is applicable for analyzing chromium picolinate in sanitarian food.

Key words：chromium picolinate;HPLC;gradient elution;sanitarian food

過去鉻和其他一些元素如鎳、鉛、鎘等一樣，一直被認為是對人畜有毒有害的元素之一[1]。隨著現代科學研究的不斷發展，到20世紀70年代，人類才逐漸認識到鉻是人和動物必需的微量元素[2]。鉻有3種價態，有二價鉻、三價鉻及六價鉻，其中六價鉻毒性最大。而三價鉻是鉻在人畜體內存在的穩定形式，其化合物參與骨骼的形成和蛋白質、脂肪、糖代謝及胰島素的生化過程，并對血紅蛋白合成及造血過程具有促進作用[2]。吡啶甲酸鉻就是三價鉻化合物，可以被人體很好的吸收，因此吡啶甲酸鉻是一種被食品藥品監督管理局允許能夠添加到保健食品中的功效成分之一。根據《營養素補充劑申報與評審規定》中規定三價鉻日攝入量范圍可知，吡啶甲酸鉻作為保健食品中的功效成分其含量控制非常重要[3]。

1 材料和方法

1.1 試劑

甲醇、乙睛色譜純；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀分析純；吡啶甲酸鉻對照品進口，批號：13363，干燥條件：105℃干燥4 h。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（型號LC2010）：日本島津公司，帶紫外檢測器，色譜工作站；DT5-2離心機：北京時代北利離心機有限公司；AS10000377超聲波清洗儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 色譜條件

C18反向色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫：25 ℃；檢測波長：254 nm；流速：0.5 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：磷酸鹽緩沖溶液∶甲醇∶乙腈梯度洗脫，見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

1.4 測定方法

1.4.1 標準品溶液制備

稱取105℃干燥4 h的吡啶甲酸鉻對照品0.01161 g于25 mL容量瓶中，加甲醇∶水=1∶1完全溶解并定容至刻度，即為0.4644 mg/mL吡啶甲酸鉻標準溶液。

1.4.2 標準系列

取上述吡啶甲酸鉻標準溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 分別置于 10 mL 容量瓶中，以甲醇∶水=1∶1水溶液定容至刻度（相當于每毫升含吡啶甲酸鉻分別為 0、4.644、9.288、18.576、37.152、55.728、74.304、92.88 μg），搖勻，經 0.45 μm 濾膜過濾后備用。

1.4.3 樣品處理

準確稱取混勻的樣品約2 g左右（精確至0.1 mg），于25 mL容量瓶中，加甲醇∶水=1∶1水溶液約20 mL，超聲提取10 min，并用甲醇∶水=1∶1水溶液定容至刻度，搖勻后轉移至離心管中，以3000 r/min離心10 min，經0.45 μm濾膜過濾后備用。

1.4.4 測定

按照上述儀器條件，將標準系列溶液從低到高依次進樣上機測定，以保留時間定性，以峰面積為縱坐標，標準系列濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，并求出回歸方程。樣品溶液依次進樣，同樣以保留時間定性，以峰面積從標準工作曲線或回歸方程計算吡啶甲酸鉻濃度。圖1為標準系列中9.288 μg/mL譜圖，圖2為某樣品譜圖。A為吡啶甲酸鉻峰。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

2.1.1 磷酸鹽緩沖溶液-乙腈體系

首先選擇了磷酸鹽緩沖溶液-乙腈作為流動相體系，磷酸鹽緩沖溶液∶乙腈=85∶15，分離效果不好；在此基礎上調整了流動相的比例，磷酸鹽緩沖溶液：乙腈從70∶30到92∶8，其分離效果都不是很好，故對其它流動相體系進行了試驗。

2.1.2 磷酸鹽緩沖溶液-甲醇-乙腈體系

根據有關資料報道對磷酸鹽緩沖溶液-甲醇-乙腈流動相體系進行了試驗，當磷酸鹽緩沖溶液∶甲醇∶乙腈=85∶10∶5時樣品中吡啶甲酸鉻與其它組分分離的較好，因此選擇了磷酸鹽緩沖溶液∶甲醇∶乙腈=85∶10∶5 作為流動相。

2.1.3 流動相中磷酸鹽緩沖溶液pH

試驗中對流動相中磷酸鹽緩沖溶液pH進行了考察，分別對 pH=3、pH=4、pH=5.8、pH=7.8 進行了比對試驗，結果發現pH不僅對保留時間產生影響，而且對分離效果影響很大。pH=3時吡啶甲酸鉻保留時間在19 min~20 min之間，分離效果不理想。pH=4、pH=7.8時吡啶甲酸鉻保留時間均在15 min~16 min左右，但兩者分離效果差異很大，pH=7.8時樣品分離效果不好，且保留時間漂移較大。pH=4時分離效果尚可，保留時間穩定，但靈敏度稍差，標準系列中4.644 μg/mL的響應值為127088。pH=5.8時吡啶甲酸鉻保留時間在14 min左右，保留時間穩定，且相對其它pH磷酸鹽緩沖溶液分離效果較好，靈敏度較高，標準系列中4.644 μg/mL的響應值為184155。綜合考慮分離效果、保留時間、靈敏度等因素確定流動相中磷酸鹽緩沖溶液pH=5.8為最佳。

2.2 梯度洗脫

眾所周知保健食品成分較復雜，若按上述條件等度洗脫每個樣品大約需要80 min左右才能完成所有組分的洗脫，造成樣品分析時間過長，既影響工作效率又浪費試劑試藥，因此試驗中采用了梯度洗脫法，并對梯度洗脫時間進行了摸索試驗，通過比較認為1.3色譜條件表中洗脫時間較為合適，45 min既能完成樣品所有組分的洗脫，節省了近一半的分析時間，且不影響樣品分析結果。

2.3 線性關系

取1.4.2標準系列按上述條件上機測定，其結果見表2。

表2 吡啶甲酸鉻標準系列檢測結果Table 2 Test results of standard series for chromium picolinate

以峰面積為縱坐標，標準系列濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，線性回歸方程為：

Y=39994X-4001.5相關系數R=0.9997從表2及相關系數R可以看出吡啶甲酸鉻濃度在0～92.88 μg/mL之間具有良好的線性關系。

2.4 吡啶甲酸鉻加標回收率、精密度、穩定性試驗

2.4.1 加標回收率

取已知吡啶甲酸鉻含量為20 mg/100 g的樣品做2個濃度加標回收實驗，每個濃度作6份平行樣品，每份約2 g，濃度一各加0.4644 mg/mL吡啶甲酸鉻標準溶液1 mL，濃度二各加0.4644 mg/mL吡啶甲酸鉻標準溶液2 mL，按上述樣品處理方法定容25 mL制備樣品溶液，按上述儀器條件上機測定，結果見表3。

表3 吡啶甲酸鉻加標回收實驗Table 3 Standard addition recovery experiments of chromium picolinate

2.4.2 方法精密度試驗

取混合均勻相同樣品6份按上述相同方法處理樣品上機測定，結果見表4。

表4 吡啶甲酸鉻方法精密度實驗結果Table 4 The results of method precision for chromium picolinate

2.4.3 穩定性試驗

將處理好的某樣品及標準系列中18.576 μg/mL標準溶液分別放置 1、8、16、24、48 h 在相同條件下測定，其保留時間、峰面積均無明顯變化，結果表明處理后的樣品溶液及標準溶液在48 h內穩定。

3 結論

一般來說保健食品成分都很復雜，檢測過程中影響及干擾因素較多，因此能夠取得好的分離效果非常重要。相對于GB/T 5009.195-2003保健食品中的吡啶甲酸鉻含量的測定[4]及參考文獻保健食品中吡啶甲酸鉻的高效液相色譜測定法[5]，本研究建立的高效液相色譜法—三元流動體系梯度洗脫測定保健食品中吡啶甲酸鉻，具有快速、準確、穩定、分離效果好，出峰時間適中等優點，通過梯度洗脫大大縮短了檢驗時間。在本實驗研究范圍內吡啶甲酸鉻具有良好的線性關系、回收率及精密度，已運用于某些膠囊、片劑保健食品中功效成分—吡啶甲酸鉻的檢測。

[1]李敏,郭書明,袁寶清,等.吡啶甲酸鉻的生物學作用及其應用[J].河南畜牧獸醫,1999,20(9)：20-21

[2]李致寶,韋少平,夏中生,等.吡啶甲酸鉻的研究概述及其應用進展[J].化工技術與開發,2011,40(7)：11-14

[3]國家食品藥品監督管理局.國食藥監注[2005]202號《營養素補充劑申報與評審規定(試行)》[S].北京：國家食品藥品監督管理局,2005：2

[4]中華人民共和國衛生部,中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.195-2003食品衛生檢驗方法理化部分(二)：保健食品中的吡啶甲酸鉻含量的測定 [S].北京：中國標準出版社出版,2003：543-547

[5]廖一民.保健食品中吡啶甲酸鉻的高效液相色譜測定法[J].預防醫學情報雜志,2005,21(6)：751-753

Determination of Chromium Picolinate in Sanitarian Food with Gradient Elution-HPLC

NA Hai-qiu,MA Dian-jun,ZHAO Fei
（Liaoning Institute for Food and Drug Control,Shenyang 110023,Liaoning,China）

2012-01-12

那海秋（1960—），女（滿），高級工程師，本科，主要從事食品保健品檢測及方法研究。