傳統魚制品中優良葡萄球菌的篩選與鑒定

張琦琳，林勝利，聶小華

（浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江杭州310014）

傳統魚制品中優良葡萄球菌的篩選與鑒定

張琦琳，林勝利，聶小華*

（浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江杭州310014）

從鹽干魚及糟腌魚中分離純化得到158株葡萄球菌，按照肉制品發酵劑篩選標準，獲得3株優良葡萄球菌S8、S61和S92，其具有良好的生長特性及耐鹽性。經梅里埃VITEK-2全自動微生物系統鑒定及16S rDNA序列分析，優良葡萄球菌S8、S61和S92分別為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）。

傳統魚制品，葡萄球菌，篩選，鑒定

Abstract：According to the standards of meat fermentation starter，three Staphylococcus strains（S8，S61 and S92）with excellent characteristics were isolated and screened from traditional fish products.And the results of BioMerieux VITEK-2 automation microbe system and 16S rDNA sequence analysis showed that they were Staphylococcus warner，Staphylococcus sciuri and Staphylococcus xylosus respectively.

Key words：traditional fish products；Staphylococcus；screening；identification

大量研究結果表明，葡萄球菌在發酵制品的風味形成中發揮著重要作用，近年來逐步成為國內外傳統食品的研究熱點。已有研究發現，葡萄球菌可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，對脂肪自動氧化引起的酸敗及由過氧化氫酶導致的褪色具有良好的抑制作用，同時其分泌的蛋白酶和脂肪酶可促進發酵食品中特殊風味的形成與積累，有效改善產品品質[1-3]。Asiedu M[4]等人從非洲西部的一種自然發酵魚腸Enam Ne-Setaakye中成功分離出葡萄球菌。Fukami K[5-6]等人從日本鯖魚魚露中成功分離出木糖葡萄球菌，并將其應用于泰國魚露發酵，顯著提高了魚露的風味。Anihouvi VB[7]等人從發酵木薯魚中分離出芽孢桿菌、葡萄球菌、微球菌、鏈球菌、假單胞菌等，其中芽孢桿菌和葡萄球菌為優勢菌株，分別占分離菌株總數的48.7%和27.3%，并且已證明其擁有適度的蛋白酶和脂肪酶活力。Tremonte P[8]等人將葡萄球菌、玫瑰微球菌聯合乳酸菌發酵培養，研究表明葡萄球菌、玫瑰微球菌不但可促進乳酸菌的生長，還可以增強菌株的蛋白水解活性。本實驗以鹽干魚、糟腌魚等傳統魚制品為原料，依據肉制品發酵劑的篩選標準，對其制品中葡萄球菌進行分離純化，以期得到適合生產發酵魚肉制品的優良菌株，為進一步探討葡萄球菌在魚制品的應用奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽干魚和糟腌魚 實驗室自制；MSA培養基 蛋白胨10g，牛肉膏1g，D-甘露醇10g，氯化鈉75g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.6，121℃，滅菌20min，MSA固體培養基在此基礎上添加18g/L的瓊脂；耐鹽性實驗培養基MSA液體培養基分別添加3%、6%、9%和12%的NaCl；產H2S培養基（醋酸鉛紙條法） 蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏10g，半胱氨酸0.5g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.4，112℃，滅菌20～30min。另將普通濾紙剪成0.5～1cm寬的紙條，用5%～10%的醋酸鉛溶液將紙條浸透后烘干，置于培養皿中滅菌備用；葡萄糖產氣培養基 MSA液體培養基，加入倒置的杜氏小管，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.625mL，121℃滅菌20min，配制時先將蛋白胨加熱溶解，調pH后加入溴甲酚紫，再加入葡萄糖；氨基酸脫羧酶培養基 蛋白胨5g，酵母提取物3g，葡萄糖1g，蒸餾水1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，L-氨基酸5g或DL-氨基酸10g，pH6.8；石蕊牛奶培養基10g脫脂奶粉溶解于100mL水中，再加入4mL濃度為25g/L的石蕊，分裝試管，113℃滅菌15min；蛋白酶檢測培養基 以MSA固體培養基為基礎添加15%脫脂奶粉；脂肪酶檢測培養基 以MSA固體培養基為基礎添加15%的牛油及中性紅指示劑。

超凈操作臺、YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z型恒溫生化培養箱、GX-9070-MBE型恒溫鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司；SP-75紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SKY-200B震蕩培養箱 上海蘇坤實業有限公司；Phs-3C型數字酸度計 杭州東星儀器設備廠；85-2數顯恒溫定時磁力攪拌器 杭州儀表電機有限公司；BS/BT4202S型Sartorious電子天平 賽多利斯公司；PCR儀 美國BIO-RAD。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄球菌的分離純化 無菌條件下，取鹽干魚、糟腌魚各10g，分別置于90mL無菌生理鹽水中勻漿并進行梯度稀釋，選取2～3個適合稀釋梯度，采用MSA培養基傾注平板，30℃培養24h。隨機挑選單一菌落，平板劃線進行分離，得到158株單一菌株[4]。

1.2.2 優良葡萄球菌的篩選 將分離得到的單一菌株進行革蘭氏染色，過氧化氫酶活性檢測，溶菌酶、溶葡萄球菌素、呋喃唑酮、桿菌肽敏感性實驗，得葡萄球菌疑似菌株。在此基礎上進一步進行凝固酶實驗、溶血實驗、產粘實驗、葡萄糖產氣實驗、產H2O2實驗、氨基酸脫羧酶實驗、產氨實驗、產H2S實驗[9-10]、蛋白酶活性[11-12]及脂肪酶活性[12]檢測完成菌株的篩選。

1.2.3 生長曲線的測定 將篩選所得菌株接種于MSA液體培養基，于30℃、150r/min下培養，每隔2h取樣一次，于680nm測定OD值，以未接菌的MSA液體培養基為空白對照液。

1.2.4 耐鹽性實驗 將篩選所得菌株接種到分別添加有0%、3%、6%、9%、12%NaCl的MSA液體培養基中，于30℃、150r/min下培養24h，以未接菌的MSA液體培養基作為空白對照液，于680nm測定OD值。

1.2.5 梅里埃VITEK-2系統鑒定 待測菌株經純培養后，采用法國梅里埃生物公司革蘭氏陽性鑒定卡，VITEK-2全自動微生物鑒定分析系統進行鑒定，嚴格按照操作說明進行操作。

1.2.6 16S rDNA的PCR擴增及序列分析 將篩選所得菌株接種至MSA固體培養基中，于30℃下培養24h。應用一對通用引物（正向引物16S rDNA-F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；反向引物16S rDNAR：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3）以基因組DNA為模板PCR擴增16S rDNA基因[13]。

PCR反應體系（50μL）：引物16S rDNA-F和16S rDNA-R各1.5μL，10×PCR緩沖液5μL，dNTP（2.5mmol/L）3μL，Taq酶（5U/μL）1μL，重蒸水38μL。滅菌牙簽挑取適量菌體，加入反應體系內。

PCR程序設置如下：94℃預變性5min，94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，經35個循環后72℃延伸10min。

PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交上海INVITROGEN公司進行測序，測得序列與NCBI數據庫中已知序列進行比對及相似性分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄球菌的分離及篩選

采用MSA培養基，從鹽干魚和糟腌魚中分離純化得158株單一菌株，其中革蘭氏陽性、球狀、H2O2酶陽性、溶葡萄球菌素和呋喃唑酮敏感、溶菌酶和桿菌肽不敏感的葡萄球菌疑似菌126株。依據肉制品發酵劑篩選標準，篩選出能夠耐受6%NaCl、發酵蔗糖不產粘、發酵葡萄糖不產氣、不產H2O2、不產H2S、不產氨、不具有氨基酸脫羧酶活性及凝固酶反應陰性、溶血實驗陰性，同時具備良好的蛋白酶及脂肪酶活力的優良葡萄球菌株3株（S8、S61及S92），如表1。

表1 篩選葡萄球菌菌體形態及生理生化實驗結果Table 1 Results of mycelia morphology and physiological biochemical test

2.2 優良葡萄球菌的生長特性

2.2.1 生長曲線 將篩選得到的3株優良葡萄球菌進行液體培養，分析其生長情況，如圖1所示。由圖可知，優良葡萄球菌S8、S61和S92表現出相似的生長趨勢，皆從4h后進入對數生長期，18h后進入生長平穩期，這表明篩選得到的三株優良葡萄球菌均具備良好的生長特性。菌液OD值在0～1.0范圍內存在線性關系，當測定值超出線性范圍，則應稀釋適當比例后再進行測定，經換算最終確定菌液OD值。

圖1 優良葡萄球菌的生長曲線Fig.1 The growth curve of the excellent Staphylococcus

2.2.2 耐鹽性實驗 發酵肉制品加工過程中，食鹽具有調味、防腐保鮮及提高持水能力等作用。研究發現一定濃度的食鹽可抑制腐敗菌的生長，同時對發酵菌株也會產生一定的影響，因此一般要求發酵菌株耐鹽性可達6%[14]。

耐鹽性實驗（圖2）表明，NaCl含量對葡萄球菌的生長有著不同程度的影響，其中優良葡萄球菌S8、S61和S92在3%～6%NaCl含量的MSA培養液中生長較為旺盛，此后隨著NaCl濃度的增加，其生長情況均受到不同程度的抑制，但在含有12%NaCl含量的培養液中仍可生長，培養液OD值依然保留在0.6～1.0之間，這說明優良葡萄球菌S8、S61和S92具有較強的耐鹽性。

圖2 優良葡萄球菌的耐鹽性Fig.2 The salt tolerance of the excellent Staphylococcus

2.3 優良葡萄球菌的鑒定

2.3.1 梅里埃VITEK-2系統鑒定結果 根據梅里埃VITEK-2系統鑒定結果分析（表2），優良葡萄球菌S8可能為沃氏葡萄球菌，其匹配度為96%；優良葡萄球菌S61可能為松鼠葡萄球菌，其匹配度為95%；優良葡萄球菌S92可能為木糖葡萄球菌，其匹配度為99%。

圖3 待測菌株PCR擴增16S rDNA凝膠電泳圖Fig.3 The electrophoretogram of PCR-amplification of 16S rDNA from the strains

表2 梅里埃VITEK-2鑒定結果Table 2 Identification results by VITEKⅡsystem

2.3.2 16S rDNA分析及系統發育樹的構建 用1%瓊脂糖凝膠對優良葡萄球菌S8、S61和S92的16S rDNA擴增產物進行電泳檢測，經溴乙錠染色后，三者均在1500bp左右出現熒光條帶，與預期結果一致（如圖3）。將PCR產物送交上海INVITROGEN公司進行序列測定，測得優良葡萄球菌S8、S61和S92的序列長度分別為1460、1472、1452bp。PCR產物測得序列采用軟件DNAStar、Clustalx與GenBank數據庫中的參考序列進行Blast同源性比對，并應用MEGA4.1軟件的鄰位相連（Neighbor-joining）法構建系統發育樹（如圖4）。結果表明，優良葡萄球菌S8、S61和S92的遺傳進化分別與已知沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri G7，Staphylococcus warneriR-38534，Staphylococcus warneri R-36520）、已知松鼠葡萄球菌（StaphylococcussciuriDSM 20345，StaphylococcussciuriCTSP9，Staphylococcus sciuri R10-5A）和已知木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus AF515587，Staphylococcus xylosus AY395016，Staphylococcus xylosus 741）同處于一個最小分支，同源性高達99%～100%。

結合梅里埃VITEK-2全自動微生物系統鑒定結果，進一步確定優良葡萄球菌S8為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），S61為松鼠葡萄球菌（Staphylococcussciuri），S92為木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）。

圖4 優良葡萄球菌S8、S61、S92的系統發育樹Fig.4 The phylogenetic tree of excellent strains S8，S61，S92

3 結論

3.1 從鹽干魚和糟腌魚中篩選得到三株優良葡萄球菌（S8、S61和S92），具有較好的蛋白酶活性和脂肪酶活性，且表現出良好的生長特性和耐鹽性。

3.2 根據菌株形態特征、梅里埃VITEK-2全自動微生物系統鑒定結果及16S rDNA序列測定綜合分析，葡萄球菌S8、S61和S92分別為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）。

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Screening and identification of Staphy/ococcus from traditional fish products

ZHANG Qi-lin，LIN Sheng-li，NIE Xiao-hua*
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

TS254.1

A

1002-0306（2012）13-0178-04

2011－09－29 *通訊聯系人

張琦琳（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

國家863專題項目（2007AA09z442）。