高效液相色譜法測定頭孢呋辛酯中高分子聚合物

王 玲，胡朝新，陸紅彬，馮曉燕

蘇州致君萬慶藥業有限公司，江蘇太倉 215415

β-內酰胺類抗生素是目前臨床上最常用的抗感染藥物，但其常易引發過敏反應，甚至過敏性休克，威脅患者的生命安全。多年的研究已證明，抗生素所致的速發型過敏反應并非由藥物本身所致，而是與藥物中存在的高分子雜質有關[1]。此外，一些抗菌藥物（如鏈霉素、某些頭孢菌素）中的高分子雜質，還和藥物的毒性反應有關，故對抗菌藥物中高分子雜質進行控制具有重要的意義[2]。《中國藥典》對眾多抗生素制定了高分子聚合物檢測方法，例如:頭孢尼西鈉、頭孢呋辛鈉、頭孢替唑鈉、頭孢噻吩鈉等；其中《中國藥典》2005版二部[3]收載了11個品種21個聚合物檢查標準，2010版二部[4]在此基礎上收載了21個品種42個聚合物檢查標準。頭孢呋辛酯為脂溶性樣品，《中國藥典》2010版、USP 32版[5]、日本藥典JPⅩⅤ[6]及EP6.0[7]均收載了該品種，但均未對該藥中的高分子雜質進行控制。通過調研，采用聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物（分子量使用范圍＜10000）為填充劑的色譜柱進行試驗，成功對頭孢呋辛酯中的高分子聚合物進行分離分析，為該藥的質量控制提供了新的檢測方法，保證了藥品質量。

1 材 料

1.1 儀器

島津LC-20A型高效液相色譜儀（含LC-20AT型高壓輸送泵、SPD-20A型紫外檢測器、LC-solution色譜工作站）。

1.2 試藥

二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃（國藥集團化學試劑有限公司，色譜純）；無水溴化鋰（A Johnson Matthey Company）；頭孢呋辛酯對照品（批號:130492-200402，中國藥品生物制品檢定所，純度:80.8%）；頭孢呋辛酯樣品（本公司自制，批號:090901、090902、090903）；頭孢呋辛酯膠囊（英國葛蘭素史克公司，商品名:西力欣誖，批號:C419105）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為TSK凝膠柱G2000 HHR（7.8 mm×300 mm）；流動相:0.030 mol·L-1LiBr溶液（稱取 Li-Br 2.6 g，加二甲基甲酰胺溶解并稀釋至1000 mL）；流速:0.33 mL·min-1；檢測波長:280 nm；進樣量:20 μL；柱溫:室溫。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取頭孢呋辛酯樣品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中含頭孢呋辛酯（無水物計）0.2 mg的溶液。

2.2.2 對照溶液 精密量取供試品溶液1 mL，置

100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。

2.3 系統適用性試驗

2.3.1 空白溶劑的選擇 分別采用二甲基甲酰胺（DMF）、流動相為空白溶劑進行試驗，結果發現采用DMF為空白溶劑時，在主峰出峰位置后（約25 min處）有一明顯倒峰，影響聚合物測定，而空白流動相無任何雜質峰出現，不影響測定結果，故確定采用流動相為空白溶劑，用以配制供試品溶液。見圖1。

圖1 不同溶劑的HPLC色譜圖

2.3.2 系統適用性試驗 精密量取對照溶液20 μL，連續進樣6次，考察峰面積的相對標準偏差。試驗結果顯示，其峰面積RSD為1.4%（＜4.0%），符合要求。見圖2。

圖2 對照溶液的HPLC色譜圖

再精密量取對照溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，主峰面積應為上述對照溶液主峰面積的20%～40%。結果靈敏度測定主峰面積為122606，為對照溶液主峰面積的29.9%，符合要求。試驗表明，本色譜條件下，系統適用性良好。

2.4 聚合物重復性試驗

精密稱取頭孢呋辛酯（批號:090901）10 mg，共6份，分別置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，立即精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以聚合物測定結果計算相對標準偏差。結果表明，6次測定聚合物峰面積分別為61743、65772、63630、65346、67622、68762，RSD 為 3.1%（＜5.0%），重復性良好。

2.5 供試品溶液濃度與聚合物測定結果的相關性考察

精密稱取3份同批次供試品（批號:090901）10、20、30 mg，分別置 3 個 100 mL 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，立即精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積Y為縱坐標，以濃度X（mg·mL-1）為橫坐標，按最小二乘法進行線性回歸。結果頭孢呋辛酯在0.104～0.304 mg·mL-1范圍內，溶液濃度與聚合物峰面積呈良好的相關性，線性回歸方程為 Y=3.536×105X-3.182×103（r=0.9998）。

2.6 對照溶液的最低檢測限與定量限

取頭孢呋辛酯對照品，用流動相溶解并逐步稀釋至濃度為 0.0081 μg·mL-1時，精密量取 20 μL 注入液相色譜儀，記錄的色譜圖中主峰峰高約為基線噪音的10倍，計算本品的定量限為0.162 ng；再逐步稀釋至濃度為0.0034 μg·mL-1時，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄的色譜圖中主峰峰高約為基線噪音的2～3倍，計算本品的檢測限為0.068 ng。見圖3。

圖3 頭孢呋辛酯最低檢測限色譜圖

2.7 破壞試驗

由于本色譜系統為無水系統，無法進行酸、堿、氧化破壞試驗，為考察頭孢呋辛酯聚合物受外界條件變化情況，設計如下試驗:取頭孢呋辛酯樣品（批號:090901）適量，置敞口量瓶中，分別在高溫60℃、強光4500lx、高濕75%條件下放置10天，考察聚合物變化情況，結果見表1。

表1 頭孢呋辛酯破壞試驗聚合物測定結果（%）

試驗結果表明，頭孢呋辛酯聚合物在高溫及高濕條件下略有增加，在光照條件下增加較快，說明本品對光照較為敏感，應避光保存。同時，上述破壞條件下高分子聚合物與主峰均能有效分離，表明本色譜系統專屬性良好。

2.8 樣品聚合物測定

取3批供試品、進口頭孢呋辛酯膠囊（西力欣誖）、頭孢呋辛酯對照品、國內其他廠家生產的頭孢呋辛酯原料，分別以峰面積歸一化法、不加校正因子的自身對照法，計算供試品中聚合物的量，結果見表2、圖 4。

表2 頭孢呋辛酯聚合物測定結果（%）

圖4 頭孢呋辛酯聚合物檢查供試品色譜圖

3 討 論

3.1 色譜柱的選擇。由于頭孢呋辛酯為脂溶性樣品，不溶于水及相關助溶劑，無法采用常規的sephadex G-10型葡聚糖凝膠柱進行試驗，通過比較，試驗采用日本TOSOH公司生產的TSK凝膠柱G2000 HHR進行試驗。結果表明，該色譜柱可以有效檢測出頭孢呋辛酯樣品中的高分子聚合物。

3.2 雜質計算方法。樣品檢測結果表明，采用峰面積歸一化法、不加校正因子的自身對照法，兩種計

算方法分別測得的頭孢呋辛酯聚合物量結果一致。考慮到試驗所用溶劑為二甲基甲酰胺（色譜純），價格較為昂貴，回收處理困難，易造成環境污染；供試品溶液濃度與聚合物測定結果的相關性考察試驗結果也表明，供試品溶液在0.104～0.304 mg·mL-1范圍內，溶液濃度與聚合物峰面積呈良好的線性關系，故試驗可以采用峰面積歸一化法來計算供試品中聚合物的量。

3.3 聚合物的形成是一個動態的過程，聚合物的含量會隨時間的延長而增大，故檢測聚合物含量時應在溶液配制后立即進樣。

3.4 該方法適用于檢查頭孢呋辛酯原料及相應制劑中的聚合物含量，如頭孢呋辛酯片、頭孢呋辛酯膠囊，同時也適用于檢測其他不溶于水的酯類藥物中聚合物量，如頭孢卡品酯、頭孢泊肟酯等，為該類脂溶性藥物提供了一種聚合物控制手段。

[1]金少鴻，胡昌勤.β-內酰胺類抗生素過敏反應的研究進展[J]. 中國新藥雜志，1994，4（3）:38.

[2]胡昌勤，金少鴻.β-內酰胺類抗生素中的高分子雜質及其分析技術研究進展 [J].國外醫藥·抗生素分冊，1996，17（5）:336.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:二部[S].北京:北京化學工業出版社，2005:142.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:二部[S].北京:中國醫藥科技出版社，2010:191.

[5]The United Statespharmacopeia convention.United States pharmacopeia 32-NF27[S].2009∶1863.

[6]Japanese pharmacopeiaⅩⅤ[S].2006∶474.

[7]European directorate for quality medicines.European Pharmacopeia 6.0[S].2008∶1463.