氟他胺大鼠在體腸吸收動力學研究

馬露露 ，張廣軍 ，高保安 ，2，陳建明 ，2?

1第二軍醫大學藥學院藥劑教研室，上海 200433；2天津天士力制藥股份有限公司，天津 300410

氟他胺是一種非類固醇雄性激素拮抗劑，屬酰基苯胺類，是前列腺癌的一線治療藥物。目前氟他胺市售制劑為氟他胺片和膠囊，規格為250 mg/片（粒），每日服用3次。由于普通制劑的峰谷效應、服藥次數多等因素，氟他胺的毒副作用和患者依從性差等問題很突出[1-2]。故研究開發氟他胺緩釋片，解決現有制劑存在的問題、提高氟他胺片劑的療效和用藥安全非常必要。

本文采用大鼠在體灌注法建立了氟他胺大鼠小腸吸收模型，通過考察藥物在不同腸段、不同藥物濃度、不同聚山梨酯-80濃度的供試液中的吸收特征，研究藥物的吸收部位、吸收機制及影響吸收的因素，以期為氟他胺緩控釋制劑的研究提供依據。

1 材 料

1.1 儀器

JA5003N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；Agilent1100型高效液相色譜儀、G1314A型紫外檢測器、Agilent化學工作站（Agilent，美國）；UV1102Ⅱ型紫外分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

氟他胺原料藥（Flutamide，FLU，江蘇天士力帝益藥業有限公司，批號20110808，純度98.6%）；氟他胺對照品（中國藥品生物制品檢定所）；酚紅、烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司）；Krebs-Ringer’s緩沖液（K-R緩沖液，自配，每1000 mL含NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、MgCl20.22 g、NaH2PO40.22 g、葡萄糖 1.4 g、NaHCO31.37 g）；甲醇（色譜純）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

雄性SD大鼠，體重200～220 g，動物合格證號:SCXK（滬）2012-0002，由第二軍醫大學動物試驗中心提供。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

供試藥液Ⅰ:精密稱取適量氟他胺、聚山梨酯-80，用K-R緩沖液溶解并稀釋成氟他胺濃度約為30 μg·mL-1含 1%聚山梨酯-80的溶液。

供試藥液Ⅱ:精密稱取適量酚紅、氟他胺、聚山梨酯-80，用K-R緩沖液溶解并稀釋成酚紅濃度約為 20 μg·mL-1、氟他胺濃度約為 30 μg·mL-1含 1%聚山梨酯-80的溶液。

2.2 酚紅與氟他胺含量測定法及測定波長的選擇[3]酚紅的吸收峰在558 nm波長處，氟他胺及聚

山梨酯-80均無吸收，而在氟他胺的吸收峰227 nm波長處，酚紅和聚山梨酯-80對其測定有干擾。故以紫外可見分光光度法于558 nm波長處測定酚紅的濃度，采用HPLC法于227nm處測定氟他胺的濃度。

2.3 腸循環液中酚紅濃度的測定

2.3.1 酚紅標準曲線的繪制 參考文獻方法[4]繪制酚紅標準曲線。以吸光度（A）對酚紅質量濃度（C）進行線性回歸，得標準曲線方程:A=0.017C-0.001（r=0.9997，n=6）。低、中、高（10、30、50 μg·mL-1）3 種濃度的方法回收率分別為100.2%、100.5%、99.8%，日內及日間RSD均小于2%。

2.3.2 酚紅濃度的測定 在不同時間點取大鼠在體腸循環液，12000 r·min-1離心5 min，移取上清液0.5 mL，加入0.2 mol·L-1NaOH溶液5 mL中顯色，立即在波長558 nm處測定吸光度，將其代入標準曲線方程，求得酚紅濃度。

2.4 腸循環液中氟他胺濃度的測定

2.4.1 色譜條件[5]色譜柱:Diamonsil C18（250 mm×4.6mm，5μm）；流動相:甲醇-水（60∶40）；檢測波長:227 nm；流速:1 mL·min-1；柱溫:30℃；進樣體積:20 μL。

分別取氟他胺對照品甲醇溶液、空白腸循環液及在體腸循環后氟他胺樣品液，在上述色譜條件下測定。圖1結果表明，氟他胺的保留時間約為25.6 min，樣品液的主峰保留時間與氟他胺對照液一致，且空白液對藥物的測定無干擾。藥物的分離度和理論塔板數均符合要求。

圖1 氟他胺的HPLC圖譜

2.4.2 氟他胺標準曲線的繪制 精密稱取氟他胺對照品，用甲醇配成200 μg·mL-1的標準母液，然后準確吸取適量，用甲醇配成濃度分別為2.5、5、10、20、40、80 μg·mL-1的系列標準液，按“2.4.1”項下色譜條件取 20 μL 進樣，以濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程:Y=40.22C-7.098（r=0.9999，n=6）。用 K-R 緩沖液配制低、中、高（2.5、20、80 μg·mL-1）3 個濃度氟他胺溶液（均含1%聚山梨酯-80），取 20 μL進樣，以測得濃度和理論濃度比較，計算方法回收率。低、中、高3個濃度氟他胺溶液的平均回收率為（99.98±1.09）%，相對標準偏差（RSD）為 1.09%，方法回收率較好。低、中、高3個濃度日內精密度的RSD值分別為2.77%、1.98%、1.23%（n=6）；日間精密度的RSD值分別為2.74%、2.03%、1.77%（n=6）；該方法的精密度較好。

2.4.3 腸循環液中氟他胺濃度的測定 在不同時間點取大鼠在體腸循環液，12000 r·min-1離心 5 min，取上清液20 μL進樣，將得到的峰面積值代入標準曲線方程，計算氟他胺的濃度。

2.5 氟他胺大鼠在體腸道吸收實驗

2.5.1 藥物在空白K-R緩沖液中的穩定性考察用空白K-R緩沖液配制3份藥液，濃度分別為58.39、28.91、14.52 μg·mL-1（均含 1%聚山梨酯-80），置（37±0.5）℃水浴中孵育，分別于 2 h、6 h 取樣并測定孵育前后的藥物濃度，考察藥物在空白K-R緩沖液中的穩定性，結果基本沒有變化，表明氟他胺在空白K-R緩沖液中具有良好的穩定性。

2.5.2 腸壁物理吸附的影響 剪取清洗后的大鼠腸段約10 cm（共4段，分別為十二指腸、空腸、回腸、結腸），用玻璃棒將黏膜層翻出，置50 mL已知濃度的供試藥液Ⅰ（37±0.5）℃中孵育，分別于2 h、6 h取樣并測定孵育前后的藥物濃度，考察大鼠腸壁對藥物的物理吸附，結果基本沒有變化，表明大鼠腸壁對藥物基本無物理吸附。

2.5.3 在體全腸段吸收實驗 參照大鼠在體循環實驗方法[6-7]。選實驗前禁食16 h（自由飲水）的大鼠4只，腹腔注射20%烏拉坦溶液（0.6 mL/100 g）麻醉，然后固定在手術臺板上，沿腹中線剪開腹部，結扎膽管。自十二指腸最上端及回腸最下端各插入一玻璃插管，扎緊，用37℃生理鹽水洗凈腸內容物，用空白K-R緩沖液以1 mL·min-1流速平衡30min，排空回流液，改用200 mL供試藥液Ⅱ（含酚紅20 μg·mL-1），以流速 1 mL·min-1回流，分別于 0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h 取樣 2 mL（同時補加 2 mL 空白 K-R緩沖液）按“2.3.2”與“2.4.3”項下操作，計算得到酚紅與氟他胺的濃度。在體小腸循環6 h后，4只大鼠分別約有40%的藥物被腸道吸收。

測得循環藥液中氟他胺的剩余量:X=C×V

C∶腸循環液中氟他胺濃度；V:利用酚紅濃度計算得到的腸循環液體積。

初始藥量為 X0，其吸收百分率[8]（%）=（X0-X）/X0×100%

以小腸內剩余藥量的對數（LnX）對取樣時間t作圖[9-10]，得一直線 Y=-0.096X+8.875（r=0.9998，n=4），且剩余藥量的對數值隨時間線性下降，說明氟他胺在小腸中的吸收呈現一級動力學過程，求得吸收速率常數 Ka=（0.965±0.017）h-1。見表 1。

表1 氟他胺在大鼠小腸段的累積吸收百分率（±s，n=4）

表1 氟他胺在大鼠小腸段的累積吸收百分率（±s，n=4）

2.5.4 在體分腸段循環實驗 實驗前禁食16 h（自由飲水）的大鼠16只，腹腔注射20%烏拉坦溶液（0.6 mL/100 g）麻醉后固定在手術臺板上，沿腹中線剪開腹部，選擇所要考察的腸段:自幽門向下取10 cm為十二指腸段；距幽門15 cm處向下取10 cm為空腸段；距盲腸20 cm處向上取10 cm為回腸段；從盲腸向下取10 cm為結腸段。在各腸段兩端剪切后插管，結扎。

實驗開始后先用37℃生理鹽水沖洗腸道內容物，充分洗滌后，再送入空氣使洗滌液盡量排盡。然后用37℃空白K-R緩沖液以1 mL·min-1平衡10～20 min，再用空氣排出回流液，接著用50 mL供試藥液Ⅱ回流2 h，流速1 mL·min-1。結束后，用空氣排出藥液，將所得回流液移入100 mL量瓶中，另用空白K-R緩沖液沖洗腸道5 min后，并入量瓶。用空白K-R緩沖液定容，混勻。樣品溶液離心后，取上清液20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積并代入標準曲線計算氟他胺濃度。

實驗結束后，將腸段沿插管兩端剪下，測量腸段長度L，求算單位吸收量和單位吸收率，以腸壁通透系數Ke表示腸壁通透性。

式中m0、m分別為初始藥量和終末藥量，L為腸段長度，t為循環時間，V為循環液體積。

藥物在大鼠不同腸段的累積吸收量、吸收百分率和腸壁通透系數見表2。對氟他胺在大鼠各腸段的吸收結果進行方差分析，表明其在十二指腸、空腸、回腸以及結腸四個腸段的吸收百分率和腸壁通透系數均無顯著性差異（α=0.05，P＞0.05），說明氟他胺在整個腸段均有吸收。

表2 藥物在不同腸段的累積吸收量、吸收百分率和腸壁通透系數（±s，n=4）

表2 藥物在不同腸段的累積吸收量、吸收百分率和腸壁通透系數（±s，n=4）

腸壁通透系數Ke（cm2·h-1）0.587±0.2080.571±0.1930.593±0.1970.539±0.192

2.5.5 藥物濃度對腸吸收影響的考察 分別選用濃度為 15.48、35.18、68.48 μg·mL-1的供試藥液（KR緩沖液配制，均含1%聚山梨酯-80），進行回流實驗，其它步驟同“2.5.3”項，考察藥物濃度對吸收的影響。不同藥物濃度（15.48～68.48 μg·mL-1）供試液在大鼠腸內的吸收速率常數（Ka，h-1）為（0.092±0.010）～（0.090±0.012）；6h 的吸收百分率（%）為（38.07±1.76）～（42.80±3.37）。

對不同藥物濃度的吸收速率常數和吸收百分率進行方差分析表明，不同藥物濃度的吸收速率常數和吸收百分率均無顯著性差異（α=0.05，P＞0.05），說明藥物的吸收速率常數和吸收百分率與濃度無關，藥物吸收量與濃度呈正比關系，符合Ficks擴散原理。說明氟他胺的小腸吸收機制為被動擴散。

2.5.6 聚山梨酯-80濃度對腸吸收影響的考察 分別選用聚山梨酯-80為1%、2%、5%的供試藥液（KR 緩沖液配制，氟他胺濃度為 30 μg·mL-1），進行回流實驗，其它步驟同“2.5.3”項，考察聚山梨酯-80對吸收的影響。

藥物在不同聚山梨酯-80濃度腸循環液中吸收速率常數（Ka）和6 h的吸收百分率見表3。由表3可知，不同聚山梨酯-80濃度條件下，小腸的吸收速率常數和吸收百分率無顯著性差異（α=0.05，P＞0.05）。

表3 不同聚山梨酯-80濃度腸循環液中氟他胺的吸收速率常數和吸收百分率（±s，n=4）

表3 不同聚山梨酯-80濃度腸循環液中氟他胺的吸收速率常數和吸收百分率（±s，n=4）

3 討 論

評價藥物腸吸收動力學的方法可分為3類:體外試驗法、在體試驗法、體內試驗法[10]。其中在體試驗法不切斷血管與神經，且能夠避免胃內容物排出及消化道固有運動的生理影響[11]，較為真實地反映藥物的吸收情況，藥物在大鼠體內吸收與人體內吸收存在高度相關性[12]。故在體試驗法是目前常用的一種方法。

氟他胺在腸道內無特定吸收部位，各腸段的吸收速率常數無顯著性差異，提示氟他胺可以制成緩、控釋制劑。不同藥物濃度條件下，小腸的吸收速率常數Ka之間無顯著性差異，實驗范圍內的聚山梨酯-80的濃度（1%～5%）對藥物的吸收無影響。全腸段吸收實驗中，剩余藥量的自然對數與循環時間成線性關系，所得直線的相關系數r＞0.9，表明吸收動力學為一級吸收，吸收機制為被動擴散。了解藥物的小腸吸收特性，可以更好地指導藥物的劑型設計，所以氟他胺的小腸吸收研究對于以后控緩釋劑型的設計具有一定的指導意義。

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