獨腳當歸阿魏酸和多糖含量的測定

任曉云，尹春英，陳建中，陳曉珍，李 娜

中國科學院成都生物研究所，成都 610041

獨腳當歸是傘形科屬植物西藏凹乳芹(Vicatia thibetica de Boiss)的根，也叫野當歸，產于四川、云南及西藏，生于海拔2700～4000 m的山坡、草地、林下、河灘及灌叢內［1］。其味辛、甘、微苦，性溫。具有祛風除濕、散寒止痛等功效，主要用于風寒濕痹、中寒胃痛、腰部冷痛等癥［2］。

四川省阿壩州馬爾康一帶有以獨腳當歸充當當歸使用［1］。當歸是傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，主產我國甘肅省岷山山區，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便等功效［3］，其主要成份是阿魏酸、揮發油、多糖以及微量元素等［4］，其中阿魏酸和多糖常作為當歸藥材質量控制的指標成分［5］。阿魏酸具有抗血小板凝集和血栓;清除亞硝酸鹽、氧自由基、過氧化亞硝基;抗菌消炎、抗腫瘤、抗突變、增加免疫功能;增強人體精子活力和運動性等功能［6］。多糖是構成生命的四大基本物質之一，多糖在增強免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面發揮著生物活性作用［7］。

目前為止，對四川阿壩州一帶所產獨腳當歸的阿魏酸以及多糖含量的測定尚未見報道，更無從比較其與當歸的有效成份含量。本實驗以阿壩州紅原縣所產的兩年生獨腳當歸為材料，探索其主要成份阿魏酸和多糖含量的測定方法，比較了與當歸的藥效差異，為進一步建立獨腳當歸藥材的質量標準提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

儀器:Aglient 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司);UV-2000紫外可見分光光度計(上海奧譜勒儀器有限公司);離心機(美國賽默飛世爾科技公司);電子分析天平(瑞士METTLER公司)等。

試劑:葡萄糖標準品(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-11020603);阿魏酸標準品(成都曼思特生物科技有限公司，批號 MUST-11112204);濃硫酸(西隴化工有限公司);苯酚(重蒸餾，天津科密歐化學試劑有限公司);甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

材料:四川紅原產兩年生獨腳當歸藥材。

1.2 方法

1.2.1 獨腳當歸阿魏酸含量測定

紫外光譜掃描檢測確定HPLC檢測波長:將獨腳當歸用70%甲醇回流提取后，經稀釋到適當的濃度，在紫外-分光光度計200～400 nm的波長范圍內進行掃描，檢測其最大吸收波長為239.0 nm和320.0 nm，結合參考文獻［8］和紫外掃描結果確定選擇320 nm作為檢測波長。

采用液相色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)柱，流動相為0.5%冰醋酸(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序為:0～30 min(30%B ～50%B)，30～32 min(50%B ～95%B)，32～40 min(95%B～30%B);測定波長:320 nm;柱溫:35 ℃;流速:0.8 mL/min;進樣量:10 μL。

標準曲線繪制:精密稱取阿魏酸10.20 mg于100 mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至100 mL，得到 0.102 mg/mL儲備液。分別精密吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 分別置于 10 mL 容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至10 mL，進樣前用0.45 μm 濾膜過濾，10 μL 進樣，測定阿魏酸峰面積，用峰面積積分值與對照品質量濃度進行線性擬合，得到阿魏酸線性回歸方程。標準品的HPLC譜圖見圖1，保留時間為15.928 min。

圖1 阿魏酸標準品HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the ferulic acidstandard

樣品供試液制備:取獨腳當歸粉末(過60目篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量。用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，供阿魏酸測定。

方法學考察:對阿魏酸標準品的精密度以及供試液中阿魏酸的重現性、穩定性、回收率進行考察。

樣品測定:精密稱取獨腳當歸粉1.0 g，平行制備供試液5份，在與標準品相同的HPLC條件下，進樣10 μL，記錄色譜圖，測定色譜峰的峰面積，按外表法計算樣品中阿魏酸的平均含量。樣品的HPLC譜圖見圖2，保留時間為15.904 min。

圖2 獨腳當歸70%甲醇提取物的HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 70%methanol extract of V.thibetica

1.2.2 獨腳當歸多糖含量測定

標準曲線繪制:精密稱取葡萄糖對照品5.40 mg，于50 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并定容，配制成質量濃度為108 μg/mL的葡萄糖對照品溶液。精密量取 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分別置于干燥、具塞試管中，加蒸餾水至1.0 mL，再加入5%苯酚溶液2.0 mL，混勻，加濃硫酸 7.0 mL，充分混勻，置沸水浴加熱20 min，取出，放置至室溫。另取1.0 mL蒸餾水平行操作，作空白對照。于最大吸收波長490 nm處測定其吸光度，用吸光度與葡萄糖對照品的質量濃度進行線性擬合，繪制標準曲線。

樣品供試液制備［8］:取獨腳當歸樣品粉末(過40目篩)約2.0 g，精密稱定，加80%乙醇100 mL回流1 h，濾過，濾渣加水100 mL回流2 h，趁熱抽濾，濾液適當濃縮，用80%乙醇沉淀，靜置過夜，離心，棄上清液，沉淀用溫水溶解，轉移并定容至100 mL容量瓶中，再精密量取上述溶液1.0 mL，轉移并定容至10 mL量瓶中，供多糖測定［8］。

方法學考察:對葡萄糖標準品的精密度以及供試液中多糖的重現性、穩定性、回收率進行考察。

樣品測定:精密稱取獨腳當歸2.0 g，平行制備供試液5份，顯色并測定吸光度，按外標法計算樣品中多糖的含量。

2 結果與分析

2.1 阿魏酸和葡萄糖標準品的線性范圍

以HPLC記錄的峰面積(Y)對阿魏酸的質量濃度(X)進行直線回歸，回歸方程為 Y=58.2255X-5.0100，相關系數 r=0.9998，表明當阿魏酸在 1.02～10.20 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系;以吸光度(Y)對葡糖糖的質量濃度(X)進行直線回歸，回歸方程為 Y=0.0075X-0.0548，相關系數為 r=0.9998，表明當葡萄糖在 21.6 ～86.4 μg/mL 與吸光度呈良好的線性關系。

2.2 阿魏酸和葡萄糖標準品的精密度考察

精密吸取10.20 μg/mL的阿魏酸對照品溶液10 μL，重復進樣5次，計算色譜圖中阿魏酸的相對保留時間的RSD為0.43%，并計算阿魏酸的峰面積的RSD為0.40%，均小于2.0%，表明進樣精密度良好;另精密量取葡萄糖對照品溶液0.5 mL，加水至1.0 mL，顯色后分別測定吸光度，重復測定5次，計算RSD為0.21%。

2.3 供試液中阿魏酸和多糖的重現性考察

精密稱取獨腳當歸1.0 g，平行制備供試液5份，進樣10 μL，記錄各色譜圖，測定其峰面積，供試液中阿魏酸的重現RSD為1.62%;另精密稱取獨腳當歸2.0 g，平行制備供試液5份，精密量取供試品溶液1.0 mL，依法測定吸光度，并計算樣品多糖含量的重現RSD為1.33%。

2.4 供試液中阿魏酸和多糖的穩定性考察

精密稱取獨腳當歸1.0 g制備供試液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進樣 10μL。記錄各色譜圖，測定其峰面積，對照品在不同時間點峰面積的RSD為0.92%，結果表明供試品溶液中阿魏酸在12 h內穩定;另精密稱取獨腳當歸2.0 g，制備供試液，精密量取供試品溶液 1.0 mL，于顯色后 0、10、20、30、40、60 min，測定吸光度，多糖RSD為0.16%，結果表明供試液在顯色后1 h內穩定。

2.5 供試液中阿魏酸和多糖的回收率考察

精密稱取獨腳當歸樣品0.5 g共5份，分別加入0.102 mg/mL阿魏酸對照品溶液0.4 mL，待溶劑揮干后，按樣品測定方法提取并測定。取5次測定的平均值計算回收率99.56%(n=5)，阿魏酸回收率的RSD為1.57%，回收率實驗結果見表1;另精密稱取獨腳當歸樣品1.0 g，平行制備供試液5份，在提取液中加入一定量的葡萄糖對照液，測定吸光度，取5次測定的平均值計算回收率為100.39%(n=5)，供試液中多糖回收率的RSD為1.24%，回收率實驗結果見表2。

表1 標準品阿魏酸的回收率Table 1 Recovery rate of ferulic acid

表2 標準品葡萄糖的回收率Table 2 Recovery rate of glucose

2.6 獨腳當歸中阿魏酸和多糖的含量分析

按照藥典中阿魏酸的提取方法，用70%甲醇回流提取獨腳當歸中的阿魏酸，利用高效液相色譜法測定了獨腳當歸中阿魏酸的含量為86.10 μg/g。采用水提醇沉的方法提取獨腳當歸中所含多糖，并通過苯酚-硫酸法測定了多糖的含量為34.60mg/g。

3 討論

本實驗采用高效液相色譜法測定了獨腳當歸中阿魏酸的含量，實驗結果表明，該方法具有操作簡便、靈敏、準確等特點，可以用于獨角當歸藥材中阿魏酸的含量檢測和質量標準的控制。但是與已報道的當歸阿魏酸含量相比［8］，獨腳當歸阿魏酸含量偏低。阿魏酸作為當歸藥材質量控制的指標成分之一，如果將獨腳當歸充當當歸使用，其藥效會明顯弱于當歸。

本實驗利用多糖不溶于乙醇的性質，于80%乙醇中回流提取獨腳當歸，以除去脂溶性雜質，然后利用多糖溶于熱水的性質，在熱水中回流提取多糖，并通過改變水提液極性用乙醇沉淀出多糖，最終得到粗多糖。利用具有顯色穩定，準確可靠，重現性好，回收率高等優點的苯酚-硫酸法［9］，測定了獨角當歸中多糖的含量。實驗結果表明，該方法準確度較高，可以用于獨腳當歸藥材多糖含量檢測和質量標準的控制。該實驗同時說明了獨腳當歸中含有較豐富的多糖，為獨腳當歸進一步開發及其多糖生物學活性研究奠定了基礎。

1 Editorial Committee for Flora of the Chinese Academy of Sci-ences(中國科學院中國植物志編輯委員會).Flora of China(中國植物 志).Beijing:China Science Press，1979.Vol55，185.

2 State administration of traditional Chinese medicine of the People's Republic of China(國家中醫藥管理局).Zhonghua Bencao(中華本草).Shanghai:Shanghai Science and Technology Press，1999，15:1037-1038.

3 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2005，1:89.

4 Chen F(陳飛)，Yao C(姚成).Advances in study on the components inAngelica sinensis.Res Tradit Chin Med(中醫藥研究)，2002，18:51-54.

5 Zhao KJ(趙奎君)，Zhong M(鐘萌)，Xie JD(謝俊大).Contents comparison of ferulic acid，ligustilide and total polysaccharide in radix Angelicae sinensis from different regions.Chin J Inform Tradit Chin Med(中國中醫藥信息雜志)，2007，14(12):37-38.

6 Hu YY(胡益勇)，Xu XY(徐曉玉).Research on chemical constituents of ferulic acid and its pharmacological effects.Chin Tradi Pat Med(中成藥)，2006，28:253-255.

7 Jiang MH(姜曼花)，Qiu XM(邱細敏)，Liu SZ(劉勝姿)，et al.The extraction，purification and determination of polysaccharide inGynuradivaricata(L.)DC.Shizhen Med Mat Med Res(時珍國醫國藥)，2008，19:7412-7414.

8 Yan H(嚴輝)，Duan JA(段金廒)，Qian DW(錢大瑋)，et al.Evaluation and analysis of the quality of Angelica sinensis from different source in China.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2009，40:1988-1992.

9 Zhong FX(鐘方曉).Ren HH(任海華)，Li Y(李巖).Comparison of methods in determination of polysaccharide content.Shizhen Med Mat Med Res(時珍國醫國藥)，2007，18:1916-1917.