磷脂脂質體對三種天然黃酮化合物穩定作用

龔雙梅，趙良容，張榮榮，李曉波，楊昌英

天然產物研究與利用湖北省重點實驗室三峽大學，宜昌 443002

天然黃酮類化合物生理活性豐富并且廣泛存在于自然界，其抗氧化作用的研究已引起國內外學者的高度重視，其體外抗氧化作用主要包括直接清除超氧陰離子、羥自由基、脂質過氧化自由基等活性氧自由基、螯合金屬離子，抑制 LDL及DNA氧化損傷。但因其穩定性差、溶解性差、生物利用度不高，并存在一定毒性等缺點而限制了它們的臨床應用。近年來，包封黃酮的脂質體藥物的研究不斷涌現［1-3］，其目的包括:利用脂質體的雙層組裝結構增加藥物穩定性，減緩其本身的氧化失活過程;利用脂質體的生物相容性好，具有靶向給藥的功能，提高藥物的溶解性和生物利用度，減少藥物毒性。

除此之外，抗脂質過氧化是黃酮化合物的重要活性之一，黃酮與脂質雙層膜結合，可以阻止氧化性成分對生物膜的攻擊，同時可以螯合易引發脂質過氧化的金屬離子，從而達到保護生物膜，抑制脂質過氧化的目的。本文以木犀草素，槲皮素和山奈酚三種母體結構相同的黃酮類化合物為研究對象(結構如下圖)，以超聲法制備卵磷脂脂質體，采用生物膜探針1-苯胺基-8-萘磺酸銨(ANS)研究化合物與脂質體相互作用性質［4，5］的基礎上，通過在脂質體環境中化合物的酸離解能力及與鋁離子螯合能力的評價，探討化合物與脂質雙層的親和性質，及脂質體穩定化合物結構和性質的分子機制。

圖1 三種黃酮的結構Fig.1 Structures of three flavonoids

1 儀器與方法

1.1 儀器及試劑

UV-3010紫外可見分光光度計(日本日立公司);F-4500熒光分光光度計(日本日立公司);槲皮素 (Quercetin，Que)，山奈酚 (Kaempferol，kae)，木犀草素(Luteolin，Lut)，購于南京TCM中藥研究所，98%(HPLC)，實驗前以無水乙醇/水(7/3)配制成濃度為2×10-3mol/L儲備液;8-苯胺基-1-萘磺酸銨(8-anilinonaphthalene-1-sulphonic acid ammonium salt，ANS)，購自 Fluka 公司，純度≧ 97%，配制 0.05 mol/L的水溶液，避光保存。卵磷脂(EPC)，中國醫藥集團上海化學試劑廠產品，常用試劑均為國產分析純;實驗用水為二次亞沸水。實驗前配置pH=7.24的Tris-HCl緩沖液備用。

1.2 脂質體的制備

稱取50 mg卵磷脂，溶解于5 mL有機溶劑(氯仿/甲醇:9/1)中，于30℃旋轉蒸發除去有機溶劑，通N210 min除去殘留溶劑。然后加入50 mL Tris-HCl緩沖液，在N2保護下40℃溫浴10 min，在旋渦混合器上混勻1 min。保持低溫，繼續在N2保護下間斷性的超聲5 min(加冰塊0℃)，直到體系均勻分散。在2～4℃以3000 rpm的速度低溫離心20 min，取上層清液。得到半透明的10 mg/mL的EPC脂質體，于4℃ N2氛圍下貯存，三天內使用［6］。

1.3 光譜測定

1.3.1 ANS與載藥脂質體相互作用的熒光光譜

在含有5%(v%)脂質體的雙蒸水中，加入ANS儲備液至濃度為1.0×10-4mol/L，用熒光分光光度計記錄ANS在脂質體中的熒光光譜，熒光發射光譜的檢測條件:360 nm處激發，掃描速度:2400 nm/min，激發和發射狹縫寬度均為10 nm，記錄370～650 nm范圍內的熒光發射光譜。然后依次加入10 uL 2.0×10-3mol/L的黃酮，混合均勻，5 min后掃描熒光光譜。

在含有5%(v%)脂質體，2.0×10-5mol/L黃酮化合物的雙蒸水中，依次加入4 uL 0.05 mol/L的ANS，混合均勻，掃描熒光。

1.3.2 黃酮化合物酸解離常數pKa的紫外-可見吸收光譜法測定

在含有5%(v%)脂質體，2.0×10-5mol/L黃酮化合物的水溶液中，采用H2SO4，NaOH調節溶液酸堿度，采用紫外-可見分光光度計在200～500 nm范圍測定化合物的吸收光譜，同時準確測定溶液pH值。同時測定沒有脂質體存在時的化合物吸收譜及pH值。

1.3.3 Al3+與載藥脂質體相互作用的紫外-可見光譜響應

圖2 木犀草素對5%脂質體中的ANS熒光光譜的影響;(B)三種黃酮引起的ANS熒光猝滅的劑量關系。Fig.2 The effect of Luteoin on the fluorescence spectra of ANS in presence of 5%liposomes.The concentration of flavonoids corresponding to 0-10:0-10，0 × 10-5mol/L，λex=340 nm.ANS at a concentration 1.0 × 10-4 mol/L.(B)Dose-dependent effects of three flavoniods on fluorescence of 1.0 ×10-4mol/L ANS in presence of 5%liposomes.

將含有5%(v%)脂質體，2×10-5mol/L黃酮化合物的體系超聲1 min，靜置，逐次加入2 uL 0.01 mol/L硝酸鋁溶液，混合均勻，5 min后以水做參比，波長范圍220～500 nm，掃描吸收光譜。對照組試驗不含脂質體。

2 結果與討論

2.1 黃酮化合物對脂質體結構的影響

ANS在水溶液中的熒光很弱，與脂膜結合后，熒光強度顯著增強［7］，因此用于標記細胞膜。由于ANS定位于脂質雙層與水的交界面上，即親水和疏水相的界面，在疏水區有強烈的熒光而在水中猝滅.它不與膜的特定區域結合，外源物質(如藥物小分子)的存在可能會影響 ANS與脂雙層的結合，從而可以間接考察藥物與脂雙層的相互作用或藥物對脂雙層結構帶來的影響［8］，即脂雙層中磷脂分子的極性基端運動的程度［9，10］。如圖1A，在脂質體環境中(5%)，ANS在530 nm左右有強熒光峰，木犀草素的加入使ANS熒光強度降低并不伴隨發射峰位的紅移，說明熒光強度的降低不是由于ANS分子極性環境的改變引起的，而是由于它所結合的膜脂環境的粘滯性變化，即流動性增加引起的［4］。

表1 化合物對脂質體中ANS的表觀熒光猝滅常數Table 1 of flavonoids for ANS fluorescence in liposomes

表1 化合物對脂質體中ANS的表觀熒光猝滅常數Table 1 of flavonoids for ANS fluorescence in liposomes

Drug Luteolin Kempferol Quercetin Kqapp(104L/mol)3.4119 0.7543 0.7209

Stern-Volmer方程I0/I=1+KSV［Q］廣泛適用于熒光猝滅現象，但是當猝滅劑分布于膜相和水相之間時，僅處于膜上的猝滅劑分子［Q］m才可以猝滅膜相中ANS的熒光，所以通過藥物總濃度得到的猝滅常數應為表觀猝滅常數［11］。在低濃度進行線性擬合，得到三種化合物對ANS熒光的表觀猝滅常數，列于表1。表觀猝滅常數與藥物在兩相中的分配系數密切相關。三種化合物中，熒光猝滅常數木犀草素明顯最大，其次是山奈酚，最小的是槲皮素。表明木犀草素在脂質雙層中的分配系數大，與脂雙層的親和性好，木犀草素在水中的溶解度低，容易進入疏水性的脂雙層，從而明顯增加膜的流動性。細胞膜脂質過氧化會導致細胞膜損傷，膜不飽和脂肪酸減少，膜脂的流動性降低，預測木犀草素能明顯抑制脂質過氧化過程。

圖3 脂質體中5×10-5mol/L黃酮的存在對ANS熒光強度劑量關系的影響Fig.3 Dose-dependent effects of ANS in liposomes containing 5 ×10-5mol/L flavonoids.

為了進一步考察黃酮與脂質體的結合性質，將黃酮(5×10-5mol/L)與脂質體(5%)結合后，檢測探針ANS的熒光強度劑量關系，如圖3，在脂質體環境中，ANS的熒光強度與其濃度基本呈線性關系，而脂質體中黃酮的存在會使ANS的熒光強度受到影響，但槲皮素和山奈酚的影響并不明顯，只在ANS高濃度范圍產生一定影響，而木犀草素的存在會明顯降低ANS的發光強度。由于木犀草素的結合導致膜結構改變，流動性增加，疏水性降低，ANS的發光受到抑制，不再滿足線性的劑量關系。

因此，三種化合物可以不同程度地進入脂雙層結構，已經有文獻證明，槲皮素結合在脂質膜的極性頭部，并不能進入脂雙層內部［12］，因此對膜結構不會產生明顯影響。木犀草素能進入脂質雙層與水的交界面，參與脂質雙層結構的重新組裝，處于脂質結構的包圍之中，預示脂質膜能起到對木犀草素結構的保護作用。

2.2 黃酮化合物在脂質體中的質子解離常數pKa

酸質子解離常數pKa是藥物的重要理化參數。由于黃酮化合物在不同pH的緩沖液中紫外吸收光譜存在較大差異，因此，可以利用分光光度法測定其解離常數。隨著環境pH不同，黃酮化合物的紫外吸收光譜中出現成對的質子化峰和去質子化峰，隨著堿性增強，質子化峰逐漸下降，去質子化峰的峰值逐漸升高，表明黃酮化合物的酚羥基上的質子解離。如圖4A，木犀草素水溶液隨著pH增大，345 nm的最大吸收峰發生紅移，峰值先減小后增大，化合物本身的特征峰消失，在395 nm處形成了一個新的穩定的吸收帶，形成明顯的等色點。將化合物兩個波長處對應的吸收值分別對pH值作圖，得到兩條S型曲線，交叉點即對應于等色點，此時化合物的中性形態及去質子化態處于平衡，此時的pH可近似作為化合物的 pKa［13，14］。

圖4 稀堿(NaOH)對木犀草素的紫外可見光譜的影響;(B)脂質體中木犀草素在345，395 nm處的吸光度隨溶液pH變化曲線(內插圖為化合物在水中的情況)Fig.4 UV-Vis spectra of 2 ×10-5mol/L luteolin in water with varying concentration(1.0 ×10-5to 2.1 ×10-4mol/L)of NaOH;(B)Curves of absorbance at 345nm/395nm of luteolin vs pH in the presence of 5%(V%)EPC liposomes.Inset:Curves in water without liposomes.

在含5%脂質體中，木犀草素的吸收峰隨著體系pH值變化的規律是一致的，但出現等色點對應的pH明顯不同，脂質體本身吸光度值小，對黃酮化合物的紫外吸收光譜沒有干擾。圖4B是木犀草素在脂質體環境中兩個波長對應的吸收度與pH的關系曲線，在水中的情況以內插圖顯示，可見，在5%的脂質體中，木犀草素的345 nm的吸收峰隨著pH變化幅度較小，但395 nm處的吸收峰增大較快，形成的等色點對應的pH明顯比在水中大。脂質體中木犀草素 pKa明顯增大，為8.06(水中 pKa=7.04)。表明在脂質體環境中，木犀草素由于與脂質結合，進入脂質雙層結構，化合物的酚羥基質子離域能力減弱，去質子化變得困難。用同樣方法測得槲皮素和山奈酚的pKa，結果列于表2，兩者在脂質體環境中的pKa與水中相比分別降低了0.29，0.32。因此，在脂質環境中，槲皮素雖結合于脂雙層的極性頭部，不能完全進入脂質環境，但與游離態相比，結構仍然受到限制，在一定程度上影響了化合物的去質子化能力。相比之下，脂質雙層對木犀草素的穩定和保護作用更明顯，在中性條件下，化合物難于去質子化。黃酮含有多個酚羥基，可以提供活潑的H而發生自氧化過程，導致化合物不穩定［15］。將化合物包埋于脂質體中，可以起到穩定化合物，防止自氧化的目的。由本實驗結果看出，三種化合物雖然母體結構完全相同，但脂質體對化合物的穩定作用也存在明顯差異，木犀草素與脂質體作用親和性好，能進入脂質雙層，明顯提高化合物穩定性，而槲皮素和山奈酚與脂質體作用較弱，不能完全包埋于脂質雙層，只能在一定程度上起到穩定作用。

表2 化合物在脂質體中pKa變化值Table 2 Comparison of pKa of flavonoids in liposomes with that in water

2.3 三種黃酮化合物在脂質體中與Al3+的螯合作用

天然黃酮由于含有多個酚羥基，易與金屬離子螯合，一方面通過螯合作用達到抑制由Fe2+，Cu2+等引發的脂質過氧化;另外，黃酮與有些金屬離子的螯合物可以發揮更明顯的生物活性。近年來，Al3+被認為是一種具有明顯神經毒性的物質，易引起老年癡呆，其機制主要與鋁促脂質過氧化有關。本文考察在脂質體環境中的黃酮與鋁的螯合性質，一方面探討脂質體對化合物螯合能力的影響，同時實驗化合物在脂質環境中捕獲Al3+的能力。

圖5 A，B分別是在含有2.0×10-5mol/L木犀草素的水溶液中及載有相同濃度的木犀草素的脂質體(5%)中依次加入Al3+，記錄的紫外吸收光譜。木犀草素與Al3+螯合能力強，較低濃度的Al3+能很快與化合物螯合。木犀草素由自身的特征吸收峰(345 nm)到形成穩定的螯合峰(400 nm)，形成等色點，在水中紫外吸收光譜隨Al3+的加入變化明顯，而在脂質體中圖譜變化十分緩慢。說明脂質體對黃酮化合物與Al3+螯合具有減緩、阻礙作用，即黃酮化合物的質子轉移變得困難，使得Al3+與黃酮化合物的螯合變得困難。

圖5 Al3+加入對水溶液(A)，脂質體(B)中木犀草素紫外可見光譜的影響Fig.5 UV-Vis spectra of 2.0 ×10-5mol/L luteolin in the presence of Al3+of varying concentration(1.0 ×10-5mol/L to1.3 ×10-4mol/L)in water(A)，and in 5%liposomes(B).C(Al3+)=1.0-8.0 ×10-5mol/L.

圖6 化合物(螯合物)的吸光度隨Al3+濃度變化曲線Fig.6 Curves of absorbances of flavonoids(flavonoid-Al complexes)vs concentration of Al3+in water or in liposomes.

對另外兩種化合物的實驗可得出類似的結論，將三種化合物與螯合引起的兩組吸收峰的吸光度對應于Al3+濃度做曲線擬合，得到圖6，可以看出，在脂質體環境中，化合物的游離態與鋁復合物達到平衡時所需要的Al3+濃度明顯高于水環境。水中的木犀草素，只需要2.6×10-5mol/L的Al3+即可達到平衡，而包裹在脂質體中的木犀草素則需要6.0×10-5mol/L的Al3+，這種現象可能是由于黃酮化合物包裹在脂質體中與膜相互作用，改變了脂質體膜的物理性質［16］，降低了Al3+進入脂質體的幾率，木犀草素主要與進入脂質體中的Al3+結合，因此需要更高濃度的Al3+，同時，脂質體環境中的木犀草素酚羥基活性降低，也是螯合能力下降的重要原因。

三種化合物與脂質體的作用強度差異較大，但在脂質環境中螯合Al3+的能力并未表現出明顯差異，推測原因是三種化合物進入脂質體系的程度不同，膜結構產生差異，Al3+進入膜體系的幾率會不同。木犀草素雖然在脂質內部，但膜的流動性增加會導致Al3+進入膜體系的幾率降低，能與其螯合的程度也會減少。槲皮素和山奈酚的水溶性較好，只能結合于脂質外層的極性頭部，與水環境中的Al3+螯合，因此也保持著較強的螯合能力。因此三種化合物都能明顯抑制由Al3+引發的脂質過氧化。

3 結論

三種黃酮化合物槲皮素，山奈酚及木犀草素雖然母體結構相同，但不同位置的酚羥基會導致化合物的溶解性差異，更會導致化合物在脂質雙層的分配，與脂質體結合程度的差異，木犀草素能進入脂質雙層內部，而槲皮素和山奈酚主要結合于脂雙層外部的極性頭部，因此脂質環境中的木犀草素酚羥基去質子化能力顯著降低，pKa明顯增大，而后兩種化合物的pKa受脂質體影響較小。在脂質環境中，三種化合物與Al3+的螯合能力顯著下降，但差異并不明顯，雖然木犀草素能進入脂質雙層，但膜流動性的增加會導致Al3+進入脂質環境變得困難，因此螯合能力也明顯下降，進一步證實木犀草素與脂質體有較好的親和性。卵磷脂脂質體能對木犀草素起到明顯的穩定和保護作用，但對槲皮素和山奈酚作用較弱。

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