柿子多糖的分離純化和結構分析

張瑞妮，張海生，趙 盈，張澤炎，張 怡，杜曉旭

陜西師范大學食品工程與營養科學學院，西安 710062

柿為柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros kaki)植物，主要生長在熱帶、亞熱帶及暖溫帶地區，在中國、日本、意大利、巴西等國廣泛栽培。中國傳統醫學認為，柿子味甘、澀，性寒，歸肺經。《本草綱目》中記載:“柿乃脾、肺、血分之果也。其味甘而氣平，性澀而能收，故有健脾澀腸，治嗽止血之功”［1］。多糖(polysaccharide)是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結構復雜且龐大的糖類物質。多糖不但能治療機體免疫系統受到嚴重損傷的癌癥，也能治療多種免疫缺損病癥，如病毒性肝炎、風濕癥等，甚至可以輔助治療艾滋病和延緩衰老等［2］。因此，開發多糖資源，分析多糖結構和藥理作用，具有極其重要的現實意義。

1 材料與儀器

1.1 材料

牛心柿(Diospyros kaki):采自陜西省西安市大居安村。

1.2 主要試劑

苯酚、濃硫酸、乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、三氯乙酸、吡啶、濃硫酸、乙醇和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)等其它試劑等均為分析純。

標準單糖:D-葡萄糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-半乳糖均為Sigma公司(純度≥99.5%)。

Sephadex G-100葡聚糖凝膠(Pharmacia)。透析袋(分子截留量8000-12000):北京鼎國生物制劑公司。

1.3 儀器

RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);SHB-III循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);HHB-21CU-600電熱恒溫水槽(上海福瑪實驗設備有限公司);LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機(上海安亭科學儀器廠);CS101-2AB電熱干燥箱(重慶銀河試驗儀器有限公司);TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);真空冷凍干燥機(德國Christ Alphal-4);JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉粹機(寧波新芝生物科技股份有限公司);DBS-100電腦全自動部份收集器(上海滬西分析儀器廠);高效液相色譜儀(Agilent公司);高效氣相色譜儀(Agilent公司);U-3010紫外分光光度計(上海分析儀器廠);傅里葉變換紅外光譜儀(德國Brucher公司)。

2 實驗方法

2.1 柿子多糖粗品的制備

新鮮柿子洗凈→去蒂→切片→烘干→粉碎→過40目篩→柿子粉→乙醚脫脂→抽濾風干→80%乙醇除雜(除去小分子糖、苷類、生物堿等)→超聲波處理→熱水浸提→離心→減壓濃縮→醇沉→過濾→無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌→干燥→柿子多糖

2.2 柿子多糖的分離純化

2.2.1 季銨鹽沉淀法

將已稱量好的2 g柿子粗多糖溶解于50 mL的雙蒸水中，按體積比1∶1加入3%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，靜置12 h后4000 rpm離心30 min。上清液部分按四倍體積加入95%乙醇，產生乳白色沉淀，分離沉淀并用去離子水溶解后裝入透析袋，用流動自來水透析48 h，上清液真空冷凍干燥后得到白色絮狀多糖WPP1。用10%的氯化鈉水溶液將離心后的沉淀部分進行溶解，再加入四倍體積的95%的乙醇，產生淺棕色的沉淀，分離沉淀并用去離子水溶解后裝入透析袋，流動自來水透析48 h，上清液進行真空冷凍干燥后得淺棕色多糖WPP2［3］。

2.2.2 Sephadex G-100 柱層析法

Sephadex G-100葡聚糖凝膠用適量蒸餾水沸水浴6 h，充分溶脹后，抽氣裝柱(層析柱規格2.4 ×45 cm)，平衡12 h。將季銨鹽沉淀法分離得到的柿子多糖組分用少量蒸餾水溶解后上樣。用蒸餾水洗脫，流速0.4 mL/min，分部收集器按每管3 mL進行收集，收集的100管洗脫液用苯酚-硫酸法檢測，繪制洗脫曲線，根據洗脫曲線收集多糖。將收集液進行濃縮、透析、真空冷凍干燥［4］。

2.3 柿子多糖的純度鑒定

采用高效液相色譜(HPLC)法對柿子多糖的純度進行測定。稱取柿子多糖適量，配制2 mg/mL濃度多糖溶液，進行HPLC分析。色譜柱采用SB804凝膠柱，流動相為高純水，流速為0.8 mL/min，柱溫為30℃，進樣量為20 μL，檢測器為示差折光檢測器。

2.4 柿子多糖分子量的測定

采用高效液相色譜(HPLC)法對柿子多糖的分子量進行測定。色譜柱采用SB804凝膠柱，流動相為高純水，流速為0.8 mL/min，柱溫為30℃，檢測器為示差折光檢測器。

標準曲線的制作:以標準葡聚糖為標準品繪制標準曲線，葡聚糖濃度為2 mg/mL，進樣量20 μL，以標準分子量的對數值為縱坐標，以色譜峰的保留時間為橫坐標做標準曲線。

樣品的測定:色譜條件同標準曲線，樣品濃度為2 mg/mL，進樣量為20 μL，利用標準曲線計算柿子多糖的相對分子量［5］。

2.5 柿子多糖單糖組成的測定

采用氣相色譜法(GC)。稱取5 mg經P2O5干燥的多糖樣品溶于2 mol/L三氟乙酸(TFA)，于110℃條件下4 h使其完全水解。按照文獻［6］方法制備糖腈乙酸酯衍生物，進行GC分析。對照標準單糖:D-葡萄糖(D-glucose)、D-甘露糖(D-mannose)、L-阿拉伯糖(L-arabinose)、D-木糖(D-xylose)、L-鼠李糖(L-rhamnose)、D-半乳糖(D-galactose)。色譜條件:ThermoTR-5石英毛細管柱(30 m ×0.32 mm)，FID檢測器，程序升溫至150℃保持1 min，以7℃/min速度升溫至190℃保持2 min，以15℃/min速度升溫至260℃保持2 min，進樣溫度為280℃，檢測器溫度為260℃。氣流速度，氮氣10 mL/min，空氣200 mL/min，氫氣 30 mL/min。

2.6 柿子多糖的光譜分析

2.6.1 紫外光譜分析

稱取柿子多糖的兩個組分各5 mg，分別配成5 mg/mL的水溶液。以蒸餾水為對照，190～900 nm區域紫外光譜掃描［7］。

2.6.2 紅外光譜分析

稱取柿子多糖的兩個組分各1 mg，分別與100 mg的KBr混勻，研磨10 min，壓片，4000 ～400 cm-1上紅外光譜掃描［8］。

2.7 柿子多糖的環境掃描電鏡觀察

取柿子多糖WPP1、WPP2樣品適量，粘附于帶有雙面膠的樣臺上，吹去未粘附的多糖粉末后置于離子濺射儀中噴鍍導電金膜后，在Quanta 200環境掃描電鏡下進行觀察，拍照［9］。

3 結果與分析

3.1 柿子多糖的分離純化和純度鑒定

3.1.1 分離純化

季銨基上的陽離子可與糖胺聚糖的陰離子形成季銨絡合物(聚陰離子鹽)極不溶于水，但能溶于一定濃度的無機鹽。柿子多糖提取液經過季銨鹽沉淀分離后得到了兩個組分WPP1和WPP2。

為了得到均一多糖組分，將WPP1和WPP2采用凝膠層析柱進一步純化，如圖1(A、B)可知，WPP1和WPP2分別是以單一峰對稱出現，表明WPP1和WPP2為均一多糖，可作進一步的結構分析。

圖1 WPP1(A)及WPP2(B)的Sephadex G-100柱層析圖Fig.1 Sephadex G-100 elution curves of WPP1(A)and WPP2(B)

3.1.2 純度鑒定

采用季銨鹽沉淀法和凝膠柱層析分離純化的柿子多糖WPP1和WPP2經HPLC分析均為均一性多糖，如圖2(A、B)所示。

圖2 WPP1(A)及WPP2(B)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of WPP1(A)and WPP2(B)

3.2 柿子多糖分子量的測定結果

對分子量已知的標準葡聚糖進行HPLC分析，以標準分子量的對數值為縱坐標，以色譜峰(標準葡聚糖)的保留時間為橫坐標，繪制Mw-RT標準曲線，線性回歸方程為 lgMw=8.9689+(-0.5545RT)，R2=0.9987，其中Mw為已知標準葡聚糖平均分子量，RT為標準葡聚糖的保留時間。

經分離純化得到的柿子多糖的兩個組分WPP1和WPP2的HPLC分析圖譜如圖2(A、B)所示，由回歸方程計算出柿子多糖的兩個組分WPP1和WPP2的平均分子量分別為2.05×105 Da和2.63×105 Da。

3.3 柿子多糖的單糖組成的測定結果

將標準單糖和柿子多糖WPP1和WPP2的水解產物分別進行衍生化，其糖腈乙酸酯衍生化后的GC圖譜如圖3(A、B、C)所示。由圖譜比較分析可知，WPP1和WPP2在單糖組成上存在差異，WPP1由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖和D-半乳糖四種單糖組成，根據內標物的參比，由公式R1/2=f×(A1/A2)(其中f為校正因子，A為峰面積)計算得出，四種單糖的摩爾比為 0.8831∶0.6862∶0.7022∶1;而WPP2僅由L-阿拉伯糖和D-半乳糖兩種單糖組成，其摩爾比為 0.8466∶1。

圖3 混合標準單糖(A)、WPP1(B)及WPP2(C)水解產物氣相色譜圖譜Fig.3 Gas chromatogram of mixed monosaccharide standards(A)，the hydrolyzed WPP1(B)and WPP2(C)

3.4 柿子多糖的光譜分析

3.4.1 柿子多糖的紫外光譜分析

柿子多糖WPP1和WPP2的紫外掃描結果表明，WPP1和WPP2在200 nm處有多糖的特征吸收峰，而在260 nm及280 nm處均無吸收峰，說明WPP1和WPP2不含核酸和蛋白質，在可見光部分也無吸收峰，說明不存在色素。

3.4.2 柿子多糖的紅外光譜分析

柿子多糖WPP1和WPP2的紅外光譜掃描結果如圖4和圖5所示。

圖4 WPP1的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of WPP1

多糖樣品在3421.51 cm-1處的強吸收峰，是O—H鍵的伸縮振動吸收;1650.43 cm-1處的吸收峰是結合水的吸收;1445.74 cm-1為C—O伸縮振動，這組峰的存在說明柿子多糖WPP1中含有-COO基團;1098.64 cm-1和 1000.74 cm-1處的吸收峰為 C—O伸縮振動，說明 WPP1中含有 C—O—C基團;836.09 cm-1的吸收峰為α-端基差向異構的CH變角振動峰，說明WPP1中含有α糖苷鍵化合物。640.30 cm-1處為吡喃糖骨架對稱伸縮振動吸收峰。

圖5 WPP2的紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of WPP2

由WPP2的光譜圖可知，WPP2具有多糖類物質的特征吸收峰，3443.76 cm-1處的強吸收峰，是OH鍵的伸縮振動吸收;1641.53 cm-1處的吸收峰是結合水的吸收;1556.98 cm-1處的吸收峰是由C=O的非對稱伸縮振動引起的;1414.59 cm-1為C-O伸縮振動，這組峰的存在說明柿子多糖WPP2中含有-COO基團;1080.84 cm-1處的吸收峰為C-O伸縮振動，說明柿子多糖WPP2中含有C-O-C基團;600.25 cm-1處為吡喃糖骨架對稱伸縮振動吸收峰［10］。

3.5 掃描電鏡(SEM)觀察結果

柿子多糖的環境掃描電鏡結果如圖6(A、B)。由柿子多糖的環境掃描電鏡照片可知，在高倍鏡下(×2000)可以看到柿子多糖WPP1呈片狀固體。更高倍鏡下(×5000)可以清楚的觀察到片狀的WPP1上附著有大小不等的顆粒狀聚集體，大小在0.1 μm ～ 1.5 μm 之間，這些顆粒狀聚集體可能借助于糖鏈及其分支較多的氫鍵或其它弱作用力聚集或聯接。說明WPP1為一種復合物，因為蛋白質不 可能去除完全，所以可能為糖蛋白復合物。

圖6 WPP1的掃描電鏡圖Fig.6 SEM images of WPP1

4 結論

柿子粗多糖經季銨鹽沉淀和凝膠柱層析分離純化后得到了水溶性的WPP1和10%氯化鈉鹽溶性的WPP2兩個多糖組分;柿子多糖組分WPP1和WPP2經Sephadex G-100柱層析、紫外光譜掃描及高效液相色譜法鑒定均為均一多糖，不含蛋白質、核酸和色素;高效液相色譜測定柿子多糖WPP1和WPP2的分子量分別為 2.05 ×105 Da、2.63 ×105 Da;柿子多糖WPP1和WPP2在單糖組成上存在差異，WPP1由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖和 D-半乳糖四種單糖組成，四種單糖的摩爾比為0.8831∶0.6862∶0.7022∶1。WPP2 由 L-阿拉伯糖和 D-半乳糖兩種單糖組成，其摩爾比為0.8466∶1;紅外光譜(IR)分析結果表明，WPP1是含有有α糖苷鍵的化合物，WPP1和WPP2均表現出吡喃糖的特征吸收;環境掃描電鏡(SEM)結果WPP1為附著有大小在0.1 μm ～1.5 μm之間的顆粒固體的片狀聚集體，可能為糖蛋白復合物。

要對柿子多糖的結構完全了解還需要多種化學方法、儀器分析方法和生物方法如免疫學、酶學方法的結合才能完成。關于柿子多糖的詳細結構信息還有待進一步研究。

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