馬尾松花粉中植物甾醇成分分析

孫陽恩，鈐莉妍，張 含，楊長軍，王 桐，石麗花，耿 越*

1山東師范大學生命科學學院，濟南 250014;2煙臺新時代健康產業有限公司，煙臺 264006

松花粉藥名松黃，是松科植物馬尾松、油松或同屬種植物的干燥花粉，是傳統的食藥兼用的花粉品種，具有抗衰老、調節免疫功能、抗疲勞、降血糖、美容、減肥等多種藥理作用［1］。植物甾醇作為一種天然成分因為其具有降低人體血清膽固醇從而預防心腦血管疾病的作用，而受到廣泛的關注［2，3］。在歐洲早已有相關的產品暢銷，例如知名的Bencol?［4］。國內在2010年植物甾醇獲得新資源食品批準之后(中華人民共和國衛生部.關于批準DHA藻油、棉籽低聚糖等7種物品為新資源食品及其他相關規定的公告.2010年第3號)，也有植物甾醇玉米油等產品上市，市場潛力巨大，開發前景廣闊。但關于花粉中植物甾醇的報道為數不多［5-8］，馬尾松花粉中植物甾醇的種類目前尚未有詳細報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膽固醇(純度99%)(美國Sigma公司);Sylon BFT(BSTFA+TMCS，99∶1)(美國 Sigma 公司);吡啶(色譜純)(天津科密歐公司);正己烷、醋酐、濃硫酸、冰醋酸(分析純)(國藥集團)。

1.2 儀器與設備

6890-5973氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司);TU-1810 PC紫外可見分光光度計(北京普析通用公司);5804R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 松花粉中粗甾醇的提取

稱取10 g破壁馬尾松花粉，加150 mL正己烷超聲浸提30 min，離心。上清液40℃旋蒸濃縮至剩余2 mL左右，氮氣吹干，得蒸發殘渣。加50 mL無水乙醇，10 mL KOH溶液(500 g/L)，沸水浴冷凝回流30 min。反應完之后，立即流水冷卻至室溫。將樣品轉移至500 mL分液漏斗中，用20 mL去離子水沖洗錐形瓶，洗液并入分液漏斗，然后分別用100、100和60 mL石油醚萃取3次，合并3次有機相。用蒸餾水洗至中性。萃取液經無水硫酸鈉脫水，旋蒸濃縮至2 mL，氮氣吹干，得不皂化物。冰醋酸溶解定容至10 mL。

1.3.2 顯色液配制

將醋酐和濃硫酸預先在冰箱中冷藏，取干燥的燒杯，置于冰水浴中。加入60 mL醋酐，30 mL冰醋酸，10 mL濃硫酸，混合均勻。然后加入2 mg無水硫酸鈉，4 ℃保存備用［9］。

1.3.3 L-B比色法測定波長的選擇

取5 mL顯色液于干燥潔凈的試管中，加入200 μL樣品溶液，于23℃水浴中顯色后在190～900 nm波長范圍內進行掃描。

1.3.4 L-B比色法反應時間的選擇

取5 mL顯色液加入潔凈干燥的試管中，加200 μL樣品溶液，振蕩混勻，轉移至比色皿中，在室溫(23℃)下進行時間-吸光值曲線掃描。

1.3.5 膽固醇標準溶液曲線制作

準確稱取膽固醇標準品，通過逐級稀釋的方法配成標準系列液。溶劑為冰醋酸，濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，分別測定吸光值，繪制標準曲線。

1.3.6 GC-MS定性分析

植物甾醇衍生化:取10 mg干燥的不皂化物于玻璃反應瓶中，加入200 μL 吡啶和Sylon BFT(1∶1)，溶解樣品，振蕩混勻，封口后置于70℃水浴中反應30 min。

色譜柱:Agilent HP-5石英毛細管柱(30 m ×0.25 mm，0.5 μm);升溫程序:200 ℃保持 5 min，以2℃/min升至230℃，保持10 min，再以1℃/min升至240℃，保持10 min，2℃/min升至250℃，保持20 min，2℃/min升至300℃，保持15 min;載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，恒流模式;進樣量1 μL;分流比:1∶50;進樣口溫度為280℃;電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV;傳輸線溫度290℃;離子源溫度230℃;EM電壓1447.1 V;質量掃描范圍m/z 29～800;溶劑延遲6 min。

2 結果與分析

以濃硫酸-醋酐為顯色劑，植物甾醇會產生紅→紫→藍→綠→污綠等顏色變化，最后褪色。因此可以通過測定反應產物的吸光度對甾醇總含量進行定量分析。但L-B比色法的具體實驗條件卻不盡相同，包括反應溫度，反應時間，酸試劑與樣品的比例等。實驗參照改進的L-B比色法［9］，利用可見分光光度法以膽固醇為標準品繪制標準曲線，對馬尾松花粉植物甾醇粗提物中的總甾醇含量進行測定。

植物甾醇顯色后光譜掃描結果顯示，在280 nm和620 nm處有兩個較強吸收峰，與梁博等人的光譜掃描結果相一致［10］。因此實驗選用可見光區的620 nm為L-B比色法測定馬尾松花粉中植物甾醇含量的檢測波長。

植物甾醇顯色過程中吸光值在0～12 min內迅速上升，16～32 min內在最大吸光值附近保持穩定，之后緩慢下降。吸光值可以在較長時間內保持相對穩定，反應溫和，因此實驗選擇在23℃水浴中反應20 min后進行測定，比色測定操作時間充足。

最后確定L-B比色法實驗條件為:以醋酐∶冰醋酸∶濃硫酸(6∶3∶1)為顯色劑，采用冰醋酸溶解樣品，取200 μL樣品溶液加入到5 mL顯色液中，23℃水浴反應20 min后測定吸光值。以吸光值為縱坐標，膽固醇濃度為橫坐標繪制標準曲線。標準曲線方程為:Y=0.17224x+0.00012，R2=0.99992，線性關系良好。測得馬尾松花粉中總甾醇含量為1.680 mg/g。

馬尾松花粉中植物甾醇TMS衍生物總離子流色譜圖見圖1。對比NIST08質譜庫，以及相關研究中植物甾醇TMS衍生物的離子碎片數據［11-13］，發現8種可鑒別的甾醇成分。峰1鑒定為Δ5-菜油甾醇;峰2為豆甾醇;峰3與峰1(Δ5-菜油甾醇)相比，m/z M-129和m/z 129碎片離子豐度較低，鑒定為Δ7-菜油甾醇［14］;峰4 為 β-谷甾醇;峰5 鑒定為 Δ5-燕麥甾醇，峰5之前與之相鄰的雜質峰為三十烷醇。峰6與干擾雜質分離度較差，與質譜庫的匹配度不高，結合文獻初步鑒定為禾本甾醇(質譜圖見圖2)［15］;峰7質譜圖中的m/z 69基峰，充分說明了C24上有雙鍵存在［14］，鑒定為環阿屯醇;峰8鑒定為24-亞甲基環木菠蘿烷醇，結果見表1和圖3。

表1 馬尾松花粉中植物甾醇GC-MS分析鑒定組分表Table 1 The identified phytosterol compositions of P.massoniana pollen

圖3 馬尾松花粉中植物甾醇結構式Fig.3 Chemical structures of phytosterols in P.massoniana pollen

3 結論

為準確分析馬尾松花粉不皂化物中植物甾醇組成，實驗直接對不皂化物衍生化，并進樣分析，但馬尾松花粉不皂化物中高級烷醇等干擾雜質較多，氣相分析中個別甾醇與雜質峰重疊，難以進一步分離，給甾醇的定量分析帶來困難，因此實驗采用改進的L-B比色法，以膽固醇為標準品繪制標準曲線對馬尾松花粉中植物甾醇總含量進行定量分析，快速、經濟、簡便，測得破壁馬尾松花粉中總甾醇含量為1.680 mg/g。實驗探索建立了適合于馬尾松花粉中植物甾醇總含量快速檢測的L-B比色法實驗條件，且并通過GC-MS分析鑒定出8種植物甾醇成分，其中以β-谷甾醇含量最多，Δ7-菜油甾醇、Δ5-燕麥甾醇、禾本甾醇、環阿屯醇、24-亞甲基環木菠蘿烷醇皆為在馬尾松花粉中首次檢出。

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