真菌竹黃雙向調節TNF-α誘導的L929細胞凋亡過程

張樹冰，周亞玲，李 凌，李 杰

中南大學生物科學與技術學院，長沙 410013

真菌竹黃(Shiraia bambusicola)是一種傳統的民間中藥，具有補中益氣、祛風利濕、抗菌消炎等功效，是一種非常值得開發利用的藥用真菌資源［1］。臨床上竹黃主治風濕性及類風濕性關節炎、跌打損傷、腰肌勞損、筋骨酸痛等［2］，其所含組分或成分，顯示了較強的藥理作用，具有保肝護肝、抗氧化、促凋亡、抗病毒、抗菌和抗腫瘤等功能［3-6］，其作用的有效部位、活性成分及作用機理等方面的研究尚處于起步階段。

腫瘤與炎癥具有非常緊密的關系，腫瘤與炎癥之間是一條雙向道:一方面炎癥對腫瘤發生具有促進作用;另一方面，腫瘤也可引發炎癥，彼此的信號通路之間存在著強烈對話，形成復雜的信號網絡系統［7，8］。腫瘤壞死因子 α(TNF-α)是一種主要由單核-吞噬細胞產生的細胞因子，可激活細胞凋亡和炎癥應答等信號通路，這些信號通路之間相互關聯相互制約，對細胞的最終效應取決于占主導地位的通路［9，10］。TNF-α 相關信號通路在腫瘤和炎癥之間的相互誘發、腫瘤及炎癥相關疾病治療過程中都起到非常重要的作用，是連接炎癥和腫瘤的一個調控關聯子［11］，介導腫瘤和炎癥信號通路之間的對話過程。

竹黃既具有抗炎特性又可以發揮抗腫瘤功能，而TNF-α信號通路與炎癥和腫瘤密切相關，我們推測竹黃的活性組分可能對TNF-α信號通路系統起到干預作用。最新研究也表明，成纖維細胞不僅在傷口愈合、組織缺陷和骨創傷修復等過程中發揮著積極作用，其也能對身體產生危害，與腫瘤生長與炎癥發生密切相關［12］。因此，我們以TNF-α誘導小鼠成纖維細胞(L929細胞)為模型，探討竹黃對該模型的作用方式，所涉及的TNF-α通路是腫瘤和炎癥相關信號網絡系統的重要組成部分。研究發現，真菌竹黃可以雙向調節TNF-α誘導的L929細胞凋亡過程，高濃度竹黃提取物協同TNF-α誘導L929細胞凋亡;低濃度竹黃提取物可能通過抑制COX-2表達和促進BCL-2表達等作用抵抗TNF-α誘導L929細胞凋亡過程。

1 材料及方法

1.1 索式提取法獲得竹黃總提取物

竹黃子座于60℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，然后粉碎成粉末。稱取10 g竹黃粉末用濾紙包好，置于索式提取器中，加入75%的乙醇，樣料比為1∶6，電熱套加熱至提取器中回流的液體液體顏色很淺。收集紅色液體于旋轉蒸發儀中濃縮提取液，將濃縮的提取液置于皿中，放在恒溫干燥箱中60℃干燥至恒重膏狀，稱取藥膏質量。恒重竹黃藥膏加入DMSO溶解，配成50 mg/mL的藥物原液，4℃保存，實驗時按所需的工作濃度進行稀釋。

1.2 細胞培養

L929細胞以RPMI1640培養基中(含10%新生小牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)培養，置于5%CO2、37℃培養箱中生長，3～4 d傳代1次。用0.25%胰蛋白酶消化對數生長期的L929細胞，消化90 s，去掉胰酶加入新鮮培養基，用彎頭吸管將細胞消化下來，收集于離心管中，取適量細胞懸液于血細胞計數板，進行計數，以每孔1×104細胞接種96孔板。待鏡下觀察細胞貼壁后，棄掉培養液，加入含有藥物的培養液培養細胞3 d。

1.3 細胞形態觀察和Hochest33258熒光染色

取對數生長期的L929細胞經胰酶消化，計數，以5×104細胞/孔接種6孔板中培養，待細胞長至50% ～80%滿時，加入各設計濃度組處理細胞48 h。處理完畢，吸盡培養液，加入0.5 mL含4%多聚甲醛或70%乙醇的固定液，固定30 min。去固定液，用 PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次 3 min，加入 0.5 mL Hoechst 33258染色液，避光染色5 min。去染色液后，用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3 min。最后每孔加入0.5 mL PBS在倒置顯微鏡下觀察;熒光顯微鏡下用紫外光激發，可檢測到呈藍色的細胞核，凋亡細胞的核比正常細胞小，且亮度高。

1.4 磺酰羅丹明B(SRB)法繪制細胞生長抑制作用柱狀圖

首先，棄掉培養基，每孔加入預冷的 100 μL10%三氯醋酸(TCA)溶液，4℃固定1小時，棄掉TCA固定液，1%醋酸溶液洗滌3遍，自然干燥后，每孔加入100 μL 0.4%SRB 染液，室溫染色 30 min，用1%醋酸溶液洗3遍，洗掉未與蛋白結合的染液，自然干燥后，加入150 uL 10 mM Tris堿液(pH10.5)溶解。置搖床上低速振蕩10 min后，在酶標儀上用OD490 nm波長測量各孔的吸光值。

根據吸光值計算細胞生長抑制率:細胞生長抑制率=(1-試驗組 A490/對照組 A490)×100%，實驗重復3次，應用SPCC統計軟件進行統計分析。以藥物濃度為橫坐標，細胞生長抑制率為縱坐標，繪制細胞生長抑制作用柱狀圖。

1.5 Western Blot實驗

等量的細胞總蛋白提取物，進行SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維膜上，然后進行麗春紅染色、脫色，確定轉膜成功后，脫脂奶粉封閉過夜。TBS洗滌三次后，加一抗，于37℃ 溫育2 h，TBS洗滌三次后，再加二抗，于37℃ 溫育2 h，TBS洗滌三次后進行ECL化學發光、顯影、定影。實驗以β-actin蛋白為內參。

2 實驗結果

2.1 竹黃對L929細胞的影響

Hoechst染色后，在熒光顯微鏡下觀察:陰性對照組細胞大小均勻，邊緣清晰，細胞排列緊密，在紫外激發下可見細胞核呈均質的藍色(圖1A，a);TNF-α(4 ng/mL)組細胞大量死亡，細胞密度急劇減小，細胞縮小，熒光顯微鏡下可見細胞核呈碎塊狀致密濃染(圖1B，b)，為典型的凋亡形態;120 μg/mL竹黃組細胞變圓縮小，紫外激發可見與TNF-α(4 ng/mL)組相似的核凝縮現象(圖1C，c);60 μg/mL竹黃組有很多細胞濃縮變圓，但在紫外激發下，觀察到細胞核略微變小，核染色均勻(圖1D，d);30 μg/mL竹黃組(圖1E，e)已經很難從形態學水平觀察到與陰性對照組的區別。Hoechst實驗結果顯示，通過不同濃度竹黃與L929細胞作用發現，高濃度竹黃可以誘導L929細胞凋亡，而當濃度為30 ng/mL時，對細胞基本無影響。這一結果有利于我們選擇合適的竹黃濃度(≤30 ng/mL)進行與 TNF-α(4 ng/mL)共同誘導實驗，以探求竹黃參與TNF-α信號網絡的具體作用機理。

圖1 不同濃度的竹黃作用48 h后L929細胞的形態變化(×400)Fig.1 Morphologic changes of L929 cells after treatment with different concentrations of Shiraia extracts for 48 h(×400).

2.2 竹黃雙向調節TNF-α誘導的L929細胞凋亡過程

應用SRB實驗法，我們測量不同濃度竹黃提取物對TNF-α(4 ng/mL)誘導L929細胞凋亡這一模型的影響作用。在酶標儀上用OD490 nm波長測量各孔的吸光值，然后根據公式計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率=(1-試驗組A490/對照組A490)×100%，見表 1。

表1 不同濃度的竹黃提取物對TNF-α誘導的L929細胞的影響，n=3)Table 1 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α，n=3)

表1 不同濃度的竹黃提取物對TNF-α誘導的L929細胞的影響，n=3)Table 1 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α，n=3)

*:P ＜0.05(SPSS軟件分析).

竹黃提取物濃度(μg/ml)Concentration抑制率(%)60.77% ±0.38%15+4 ng/mLTNFα 0.281 ±0.002 49.07% ±0.38%7.5+4 ng/mLTNFα 0.311 ±0.004* 43.64% ±0.77%*3.75+4 ng/mLTNFα 0.313 ±0.005* 43.37% ±0.86%*1.88+4 ng/mLTNFα 0.329 ±0.003* 40.44% ±0.52%*0.94+4 ng/mLTNFα 0.309 ±0.002* 44.14% ±0.32%*0.47+4 ng/mLTNFα 0.291 ±0.022 47.35% ±3.97%0+4 ng/mLTNFα 0.287 ±0.006 47.99% ±1.02%0+0 ng/mLTNFα(對照組)Inhibition 30+4 ng/mLTNFα 0.217 ±0.002*吸光度A490值Absorbance 0.558 ±0.005 0

以藥物濃度為橫坐標，細胞生長抑制率為縱坐標，繪制細胞生長抑制作用柱狀圖(圖2)。研究發現，竹黃提取物在濃度0.94 ～7.5 μg/mL 范圍內能減小TNF-α對L929細胞的抑制作用，且當竹黃濃度在1.88 μg/mL時，抑制效果最為明顯，此時的抑制率與TNF-α(4 ng/mL)組相比下降15.8%;當濃度大于1.88 μg/mL時這種作用隨竹黃濃度的增高而逐漸減小，當濃度小于1.88 μg/mL時隨竹黃濃度的減小而減小。當竹黃提取物濃度為15 μg/mL或者0.47 μg/mL時與陽性對照組相比沒有明顯差異;而當竹黃濃度繼續增大到達30 μg/mL時抑制率與TNF-α(4 ng/mL)組相比上升26.6%。

圖2 不同濃度的竹黃提取物對TNF-α誘導的L929細胞的影響Fig.2 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α

2.3 竹黃對COX-2蛋白表達的影響

用Western blotting分析不同濃度的竹黃提取物通常情況下在大多數組織細胞中不表達或表達極低，受炎癥或致癌物等刺激時表達迅速上調［18］。COX-2與炎癥發生以及多種癌癥的發生都密切相關，COX-2特異性抑制劑能減輕RA病人的癥狀并緩解RA引起的慢性疼痛［19］。在本研究中，TNF-α誘導L929細胞后，細胞內的COX-2表達量與陰性對照組比較顯著提高;30 μg/mL與15 μg/mL竹黃實驗組COX-2的表達量與TNF-α誘導組相比沒有顯著的差別，但 7.5 μg/mL 與 3.75 μg/mL 竹黃實驗組的COX-2的表達量逐漸減弱，推測竹黃可能通過降低 COX-2的表達量進而抑制 TNF-α誘導的L929細胞凋亡。

BCL-2(B-cell lymphoma-2)基因首先是在B細胞濾泡性淋巴瘤中被發現的，過表達BCL-2抑制細胞凋亡［20］。實驗結果表明，低濃度竹黃實驗組與TNF-α(4 ng/mL)組相比，BCL-2的表達量顯著增強。這一結果與細胞水平觀察到的竹黃濃度在7.5～1.88 μg/mL 范圍內降低TNF-α 對L929 細胞抑制率的現象是相一致的，表明在一定濃度范圍內竹黃通過誘導上調BCL-2的表達來提高細胞的存活率，從而抵抗TNF-α對L929細胞的凋亡作用。

NF-κB是一種常見的轉錄因子，它的活化形式是異二聚體，通常包括P65和P50兩個蛋白質亞單位，在許多慢性炎癥疾病中的發生和發展過程中NF-κB都發揮著至關重要的作用，最終決定細胞命運的是 TNF-信號通路間的平衡［21，22］。在本實驗中，與陰性對照組相比，各實驗組NF-κB P65蛋白表達量均上升，說明NF-κB P65蛋白是TNF-α誘導L929細胞凋亡過程中的重要調控因子，但由于其表達量并沒有隨著抑制凋亡現象發生而改變，推測其可能不是竹黃干預TNF-α信號網絡過程中的關鍵靶標蛋白，在竹黃抑制L929細胞凋亡過程中的作用不明顯，相關分子機理需要進一步論證。

4 結論

研究結果表明，真菌竹黃中含有藥理作用相反的活性物質，可以雙向調節TNF-α誘導的L929細胞凋亡過程。通過深入探索其干預TNF-α信號網絡平衡的作用機制，我們發現TNF-α信號通路中關鍵蛋白因子COX-2表達下降，BCL-2表達上調，而NF-κB基本沒有變化，推測COX-2和 BCL-2蛋白是竹黃拮抗細胞凋亡過程中的關鍵靶標蛋白，相關研究為臨床上竹黃發揮抗腫瘤和抗炎功效提供理論基礎，也為運用生物活性導向技術，結合天然藥物分離提純技術，進行竹黃相關藥物的篩選提供依據。

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