猴頭菌液體靜置發酵液的化學成分與細胞毒活性

鄭永標，魯春華，許 莉，鄭忠輝，蘇文金*，沈月毛*

1福建師范大學生命科學學院，工業微生物教育部工程研究中心，福建省現代發酵技術中心，福州 350108;2山東大學藥學院，濟南 250012;3廈門大學生命科學學院，廈門 361005

培養方式對微生物次級代謝產物有重要的影響。近期，我們采用液體靜置培養方式對食藥用價值較高的猴頭菌進行發酵培養，對發酵液的有機粗提物進行了細胞毒測定，發現猴頭菌液體靜置發酵液具有較高的細胞毒活性，為進一步闡明其中具有細胞毒活性的化學成分，我們擴大培養量，對其中的化學成分進行分離，本文對所分離并結構確定的化合物進行報道。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 菌種

猴頭菌(Hericium erinaceus)由福建農林大學菌物中心謝寶貴教授提供。

1.1.2 培養基

PD培養基。200 g馬鈴薯浸汁(馬鈴薯去皮，切成小塊，煮沸20 min，6層紗布過濾)，葡萄糖20 g，水 1 L，pH 自然。

1.1.3 分離介質

柱層析硅膠(200～300目)和薄層層析板(0.20～0.25 mm，GF254)購自青島海洋化工總廠。反相硅膠(RP-18)，Merck產品。凝膠層析硅膠(Sephadex LH-20)，Amersham Biosciences產品。

1.2 儀器

中壓液相色譜儀:BUCHI。旋轉蒸發儀:BUCHI，EYELA，STUART。核磁共振波譜儀:Bruker ARX 600。質譜儀:API 2000 LC/MS，Applied Biosystems。酶標儀:M-3550，BioRad。

2 提取與分離

2.1 猴頭菌的液體靜置發酵培養

猴頭菌斜面菌種先接種到裝有150 mL PD培養基的三角瓶中，于恒溫搖床中培養，溫度28℃，轉速200 rpm，制備猴頭菌液體菌種。取150 mL PD猴頭菌液體菌種接種到裝有3 L PD培養基的大三角瓶，共培養9瓶，于25～28℃培養室培養54 d。猴頭菌液體靜置發酵后，過濾除去菌絲體，發酵液先真空濃縮至1 L，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉脫水后濃縮，再用甲醇溶解過濾，得甲醇可溶粗提物 8.3 g。

2.2 猴頭菌化學成分的純化

猴頭菌粗提物(8.3 g，褐色浸膏)用適量甲醇充分溶解，經反相硅膠柱(170 g)層析，甲醇-水梯度(水，30∶70，50∶50，70∶30，甲醇和丙酮)分別洗脫1.5、2、3、2、1 和1 L，壓力正常后流速控制為40 mL/min，每管收集250 mL，TLC檢測合并相似的組分，分別由30%甲醇、30%甲醇、30%甲醇、50%甲醇和70%甲醇洗脫得到 Fr.1(307 mg)、Fr.2(212 mg)、Fr.3(1.3 g)、Fr.4(1.2 g)和 Fr.5(884 mg)5 個主要組分。

Fr.1(307 mg)經適量甲醇充分溶解，經凝膠(40 g)柱層析，甲醇洗脫，流速約為4～6 drop/min，每試管收集5 mL，相似組分合并得到兩個主要組分Fr.1.1(97 mg)和 Fr.1.2(186 mg)。Fr.1.1(97 mg)經反相硅膠(10 g)柱層析，10%甲醇洗脫得主要組分34 mg，接著經凝膠(40 g)柱層析，丙酮洗脫得主要組分21 mg，最后經正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮(10∶1)洗脫，TLC檢測得到化合物6(13 mg)。Fr.1.2(186 mg)經反相硅膠(10 g)柱層析，甲醇-水 (7.5∶92.5，15∶85，25∶75)梯度洗脫，分別從7.5%、7.5%和15%甲醇洗脫得3個主要組分Fr.1.2.1(92 mg)、Fr.1.2.2(48 mg)和 Fr.1.2.3(36 mg)。Fr.1.2.1(92 mg)接著經凝膠(40 g)柱層析，甲醇洗脫得2個主要組分Fr.1.2.1.1(52 mg)和Fr.1.2.1.2(20 mg)。Fr.1.2.1.1(52 mg)接著經凝膠(40 g)柱層析，丙酮洗脫得主要組分30 mg，最后經正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮(8∶1)洗脫TLC檢測得到化合物3(10 mg)。Fr.1.2.1.2(20 mg)經正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮(20∶1)洗脫，TLC檢測得到化合物4(2 mg)和5(4 mg)。

Fr.4(1.2 g)先經凝膠(140 g)柱層析，甲醇洗脫得主要組分40 mg，再經凝膠(50 g)柱層析，丙酮洗脫得到主要組分2 mg，接著經正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮(20∶1)洗脫，TLC檢測得到化合物2(1.4 mg)。

Fr.5(884 mg)先經凝膠(140 g)柱層析，甲醇洗脫得主要組分884 mg，接著經反相硅膠(30 g)柱層析，甲醇-水(60∶40，70∶30)梯度洗脫，70% 甲醇洗脫得到主要組分135 mg，再連續經凝膠柱層析，分別以甲醇和丙酮為洗脫劑，得到主要組分14 mg，最后經正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮(6∶1)洗脫TLC檢測得到化合物1(6 mg)。

3 結構鑒定

化合物1為白色膠狀物，可溶于丙酮與甲醇，ESI-MS(m/z 515.4［M+Na］+和 m/z 531.1［M+K］+)，分子式 C27H40O8;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:9.42(1H，s，H-15)，7.08(1H，d，J=5.2，H-13)，5.81(1H，t，J=8.6，H-11)，4.54(1H，d，J=5.2，H-14)，4.32(1H，d，J=7.4，H-1')，3.89(1H，dd，J=11.5，5.3，H-5'α)，3.54(1H，m，H-4')，3.37(1H，overlapped，H-3')，3.30(1H，overlapped，H-2')，3.23(1H，m，H-5'β)，2.85(1H，m，H-18)，2.65(1H，m，H-10α)，2.36(2H，m，H-2)，2.12(1H，d，J=10.7，H-5)，2.04(3H，s，H-22)，1.93(1H，m，H-10β)，1.83(1H，m，H-7α)，1.69(1H，m，H-8α)，1.58(1H，m，H-8β)，1.55(1H，m，H-1α)，1.48(1H，m，H-1β)，1.45(1H，overlapped，H-7β)，1.07(3H，s，H-16)，1.03(3H，s，H-20)，1.02(3H，s，H-19)，1.00(3H，s，H-17);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.0(C-15)，172.0(C-21)，160.3(C-13)，140.7(C-3)，138.5(C-12)，138.3(C-4)，107.7(C-1')，86.2(C-14)，78.0(C-3')，75.3(C-2')，71.2(C-4')，68.9(C-11)，67.0(C-5')，50.4(C-9)，45.9(C-6)，41.0(C-5)，39.5(C-8)，38.1(C-1)，31.3(C-7)，30.1(C-10)，29.3(C-2)，28.3(C-18)，24.9(C-17)，22.2(C-19)，21.8(C-20)，20.9(C-22)，16.8(C-16)。與文獻［1］核磁數據相比較，確定化合物1的結構為二萜糖苷化合物erinacine P(圖1)，為從猴頭菌菌絲體中分離到，本文首次從猴頭菌發酵液中分離到該化合物。

圖1 猴頭菌靜置發酵液的化學成分Fig.1 Chemical structures of compounds isolated from H.erinaceus

化合物2為白色粉狀物，溶于丙酮與甲醇，ESIMS(m/z 175.4［M+Na］+)，分子式 C8H8O3;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:6.10(1H，d，J=2.2，H-3)，6.21(1H，d，J=2.2，H-5)，2.50(3H，s，H-7)，10.1(1H，s，H-8);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.3(C-8)，167.5(C-4)，167.2(C-2)，114.1(C-1)，146.2(C-6)，111.9(C-5)，101.5(C-3)，18.4(C-7)。與文獻［2］的核磁數據對比確定化合物2的結構為 orsellinaldehyde(圖1)，orsellinaldehyde是灰樹花(Grifola frondosa)的深層發酵產物，本文首次從猴頭菌發酵液中分離到該化合物。

化合物3為無色油狀物，可溶于丙酮與甲醇，ESI-MS(m/z 171.2［M+H］+，m/z 193.1［M+Na］+)，分 子 式 C8H10O4;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.96(1H，s，H-6)，6.29(1H，s，H-3)，4.79(3H，q，J=6.4，H-7)，4.43(2H，s，H-1)，1.36(3H，d，J=6.4，H-8);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:178.7(C-4)，169.6(C-2)，152.4(C-6)，133.5(C-5)，112.4(C-3)，63.6(C-7)，60.9(C-1)，23.2(C-8)。數據分析表明該化合物為已知化合物 herierin IV［3］(圖1)。

化合物4為無色油狀物，可溶于丙酮與甲醇，ESI-MS(m/z 143.3［M+H］+，m/z165.2［M+Na］+)，分 子 式 C7H10O3;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:5.62(1H，s，H-3)，4.64(1H，m，H-6)，4.17(1H，d，J=16.7，H-1a)，4.13(1H，d，J=16.7，H-1b)，2.54(1H，dd，J=17.0，13.0，H-5α)，2.47(1H，dd，J=17.0，4.0，H-5β)，1.48(3H，d，J=6.4，H-7);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.7(C-4)，178.5(C-2)，100.7(C-3)，76.3(C-6)，60.4(C-1)，42.2(C-5)，19.0(H-7)。經與文獻［4］核磁數據比較，確定化合物4的結構為吡喃酮衍生物 erinapyrone A(圖1)。

化合物5為無色油狀物，可溶于丙酮與甲醇，ESI-MS(m/z 143.0［M+H］+，m/z 165.0［M+Na］+)，分 子 式 C7H10O3;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:5.37(1H，s，H-5α)，4.51(1H，m，H-2)，3.87(1H，dd，J=12.3，3.4，H-1a)，3.76(1H，dd，J=12.3，5.0，H-1b)，2.68(1H，dd，J=17.0，14.0，H-3α)，2.35(1H，m，H-3β)，2.08(3H，s，H-7a);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.4(C-4)，176.2(C-6)，103.5(C-5)，79.9(C-2)，62.6(C-1)，36.0(C-3)，19.6(C-7)。其核磁數據與文獻［4］的一致，確定化合物5的結構為吡喃酮衍生物erinapyrone B(圖1)。

化合物6為無色油狀物，可溶于丙酮與甲醇，分子式 C8H10O5，ESI-MS(m/z209.1［M +Na］+)，1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:5.66(1H，s，H-3)，5.75(1H，s，H-6)，4.16(1H，d，J=16.7，H-7a)，4.07(1H，d，J=16.7，H-7b)，4.40(3H，q，J=6.5，H-8)，1.23(3H，d，J=6.5，H-9);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:170.9(C-2)，101.2(C-3)，190.2(C-4)，64.6(C-5)，81.0(C-6)，59.8(C-7)，61.0(C-8)，16.8(C-9)。其核磁數據與文獻［4］的一致，確定化合物6的結構為吡喃酮衍生物erinapyrone C(圖1)。

4 Erinacine P細胞毒活性測定

把培養好的HeLa細胞制成單細胞懸液，用血細胞板計數并稀釋至細胞濃度為6×104個/mL。于96孔板中接種細胞，每孔80 μL。另設3孔無細胞、僅有80 μL培養液的用于儀器調零的空白對照孔。置37℃，5%CO2的培養箱中培養24 h，然后加入20 μL化合物erinacine P使其濃度分別為24 μM和48 μM。同時，往陽性對照孔加20 μL順鉑使終濃度為10 μg/mL，往陰性對照孔和空白對照孔各加20 μL 培養液。繼續培養 72 h，每孔加10 μL 5 mg/mL MTT。37 ℃ 反應 3 h，每孔加 100 μL 10%SDS和0.01 mol/L HCl溶解過夜。酶標儀比色測定(波長595 nm)。抑制率按下式計算。

Erinacine P細胞毒活性測定結果見表1。經SPSS 18.0統計分析表明，空白對照組、順鉑和48 μM erinacine P實驗組的吸光值無顯著差異，而陰性對照組和24 μM erinacine P實驗組差異顯著，結果說明順鉑和48 μM erinacine P完全抑制HeLa細胞的生長，抑制率為100%，而24 μM erinacine P的抑制率為88%。erinacine P顯示了較強的細胞毒性活性。

表1 Erinacine P的細胞毒活性測定Table 1 Cytotoxity investigation results for erinacine P by MTT assay

5 討論

猴頭菌子實體具有較高的食用與藥用價值，本文通過對猴頭菌靜置發酵液化學成分分離與活性實驗，表明猴頭菌的靜置發酵液也具有較高的藥用價值。據報道，本文首次從猴頭菌中分離到化合物orsellinaldehyde(2)，經流式細胞儀分析表明其可誘導人肝癌 Hep 3B細胞凋亡的作用［2］;化合物 erinacine P(1)，erinapyrone A(4)和 erinapyrone B(5)對HeLa細胞都具有細胞毒活性［4］。猴頭菌的人工栽培時間較長，子實體生長管理影響因素較多，限制了其藥用價值的開發，本文的研究為猴頭菌的開發應用提供了新的途徑，若進一步研究其深層發酵生產具有較高藥用活性價值的化學成分的工藝，則可通過工業發酵的方式來實現。

1 Kenmoku H，Sassa T，Kato N.Isolation of erinacine P，a new parental metabolite of cyathane-xylosides，from Hericium erinaceum and its biomimetic conversion into erinacines A and B.Tetrahedron Lett，2000，41:4389-4393.

2 Lin JT，Liu WH.O-orsellinaldehyde from the submerged culture of the edible mushroom Grifola frondosa exhibits selective cytotoxic effect against Hep3B cells through apoptosis.J Agr Food Chem，2006，54:7564-7569.

3 Qian FG(錢伏剛).，Xu GY(徐光漪)，Du SJ(杜上钅監)，et al.Isolation and identification of two new pyrone compounds from the culture of Hericium.Acta Pharma Sin(藥學學報)，1990，25(7):522-525.

4 Arnone A，Cardillo R，Nasini G，et al.Secondary mold metabolites:part 46.Hericenes A-C and erinapyrone C，new metabolites produced by the fungus Hericium erinaceus.J Nat Prod，1994，57:602-606.